Este método ajudará a determinar e confirmar se uma proteína em células infectadas pelo vírus da gripe sofre degradação ou clivagem por caspases e identificar os locais de clivagem da caspase. Este método requer apenas configurações básicas de laboratório de biologia molecular e celular e habilidades de pesquisa e não requer nenhum equipamento especializado ou treinamento de software. Este método pode ser adaptado para atingir objetivos semelhantes envolvendo infecção por outros vírus ou micróbios animais e exposição a estímulos externos, como toxinas e produtos químicos.
Para começar, semeie células MDCK ou A549 em uma placa de cultura celular de 12 poços. Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius sob uma atmosfera de dióxido de carbono a 5%. No dia seguinte, remova o meio de cultura antigo das células e lave as células em cada poço duas vezes com um mililitro de MEM sem soro.
Em seguida, infecte as células adicionando 400 microlitros de inóculo do vírus influenza A e coloque a placa para incubação por uma hora. Após a incubação, remova o inóculo do vírus e lave as células com MEM. Adicione um mililitro de MEM livre de soro a cada poço e incube as células como mostrado na etapa anterior.
Após 24 horas, colha as células raspando-as com um êmbolo de seringa de um mililitro e transfira-as para um tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar o tubo a 12.000G durante dois minutos à temperatura ambiente e recolher o sobrenadante. Lave o pellet celular com 250 microlitros de solução salina tamponada com fosfato e centrífuga.
Remova o sobrenadante e adicione 100 microlitros de tampão de lise celular. Misture por vórtice. Aqueça o tubo a 98 graus Celsius por 10 minutos para lisar completamente as células.
Em seguida, resolva quantidades iguais de proteína de amostras não infectadas e infectadas por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS padrão. Após a eletroforese, transfira o gel de proteína para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF e realize Western blotting. Compare os níveis de proteína nas faixas de amostra infectadas tratadas com simulação e tratamento com inibidor.
Em 100 microlitros de meio apropriado, como Opti-MEM, diluir 100 nanomolares de controle ou siRNA de caspase, ou volume apropriado de reagente de transfecção. Incubar durante cinco minutos à temperatura ambiente. Misture 100 microlitros de cada solução de siRNA com 100 microlitros de solução de reagente de transfecção e incube por 20 a 45 minutos à temperatura ambiente.
Divida e adicione 100.000 células MDCK ou A549 em 800 microlitros do meio de crescimento completo. Adicione 200 microlitros de complexo reagente de transfecção de siRNA e adicione esta suspensão a uma placa de cultura de 12 poços. Incubar as células a 37 graus Celsius sob uma atmosfera de dióxido de carbono a 5% durante 72 horas.
Infectar as células com o vírus da gripe A, mas sem inibidores. Realize Western blotting e compare os níveis de proteína como mostrado anteriormente. Localize os motivos de clivagem da caspase XXXD e DXXD no polipeptídeo.
Mutar o ácido aspártico P1, dois ácidos glutâmicos ou alanina por mutagênese sítio-dirigida e confirmar por sequenciamento de DNA. Em 100 microlitros de um meio apropriado, diluir dois microgramas de DNA plasmático do tipo selvagem ou mutante ou o volume recomendado do reagente de transfecção e incubar os tubos por cinco minutos à temperatura ambiente. Misture 100 microlitros de solução de DNA plasmático com 100 microlitros da solução reagente de transfecção e incube por 20 a 45 minutos à temperatura ambiente.
Enquanto isso, divida e adicione 300.000 células MDCK ou A549 a 800 microlitros de meio de crescimento completo. Adicione 200 microlitros de complexo de reagente de transfecção de DNA e adicione esta suspensão a uma placa de cultura de 12 poços. Incubar a placa a 37 graus Celsius sob uma atmosfera de dióxido de carbono a 5%.
Após 48 horas, infectar as células com o vírus influenza A sem inibidores. Realize Western blotting e compare os níveis de proteína como mostrado anteriormente. Usando Western blotting, a degradação da cortactina do hospedeiro por caspases do hospedeiro induzidas pela influenza foi avaliada.
O tratamento das células infectadas pelo vírus influenza com um inibidor da caspase-3 resultou no resgate da cortactina e na degradação viral da NP. A quantificação da intensidade das bandas de cortactina e sua normalização com a banda de actina correspondente mostrou que o nível de cortactina em células infectadas tratadas com inibidor de caspase-3 foi maior em comparação com células infectadas não tratadas. Em células empobrecidas de caspase-6 ou caspase-7.
Não foi observada recuperação significativa nos níveis de polipeptídeo de cortactina, enquanto nas células empobrecidas de caspase-3, a cortactina recuperada do vírus influenza induziu degradação. A quantificação e comparação dos níveis de polipeptídeos mostrou que o nível de polipeptídeo de cortactina em células infectadas com expressão de caspase-3 empobrecida foi maior do que as células com expressão normal de caspase-3. A mutação do ácido aspártico na posição 116 para o ácido glutâmico tornou o polipeptídeo de cortactina resistente à degradação induzida pelo vírus da gripe.
A quantificação e comparação dos níveis de polipeptídeos mostrou que o nível de polipeptídeo de cortactina mutante em células infectadas foi maior do que o de polipeptídeo de cortactina do tipo selvagem. É necessário gerar dezenas de mutantes e realizar Western blotting repetido para identificar o local de clivagem da caspase no polipeptídeo. Um ensaio bioquímico in vitro contendo caspase purificada e polipeptídeo alvo poderia ser desenvolvido para confirmar que a proteína de interesse é um substrato direto à base de gás.
Este protocolo ajudará a entender o significado, a degradação ou clivagem da proteína-alvo no sistema que está sendo estudado, como a infecção por vírus ou uma doença.
