Questo metodo aiuterà a determinare e confermare se una proteina nelle cellule infette da virus dell'influenza subisce degradazione o scissione da parte delle caspasi e identificare i siti di scissione delle caspasi. Questo metodo richiede solo impostazioni di laboratorio di biologia molecolare e cellulare di base e capacità di ricerca e non richiede alcuna attrezzatura specializzata o formazione software. Questo metodo può essere adattato per raggiungere obiettivi simili che coinvolgono l'infezione con altri virus animali o microbi e l'esposizione a stimoli esterni, come tossine e sostanze chimiche.
Per iniziare, seminare cellule MDCK o A549 in una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius sotto un'atmosfera di anidride carbonica del 5%. Il giorno successivo, rimuovere il vecchio terreno di coltura dalle cellule e lavare le cellule in ciascun pozzetto due volte con un millilitro di MEM senza siero.
Quindi, infettare le cellule aggiungendo 400 microlitri di inoculo del virus dell'influenza A e posizionare la piastra per l'incubazione per un'ora. Dopo l'incubazione, rimuovere l'inoculo del virus e lavare le cellule con MEM. Aggiungere un millilitro di MEM senza siero a ciascun pozzetto e incubare le cellule come mostrato nel passaggio precedente.
Dopo 24 ore, raccogliere le cellule raschiandole con uno stantuffo della siringa da un millilitro e trasferirle in un tubo da 1,5 millilitri. Centrifugare il tubo a 12.000 G per due minuti a temperatura ambiente e raccogliere il surnatante. Lavare il pellet cellulare con 250 microlitri di soluzione salina tamponata fosfato e centrifugare.
Rimuovere il surnatante e aggiungere 100 microlitri di tampone per lisi cellulare. Mescolare per vortice. Riscaldare il tubo a 98 gradi Celsius per 10 minuti per lisare completamente le cellule.
Quindi, risolvere quantità uguali di proteine da campioni non infetti e infetti mediante elettroforesi standard su gel di poliacrilammide SDS. Dopo l'elettroforesi, trasferire il gel proteico su una membrana nitrocellulosa o PVDF ed eseguire Western blotting. Confronta i livelli di proteine nelle corsie campione infette trattate con finzione e inibitori.
In 100 microlitri di mezzo appropriato, come Opti-MEM, diluire 100 nanomolari di controllo o siRNA caspasi, o volume appropriato di reagente di trasfezione. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Mescolare 100 microlitri di ciascuna soluzione di siRNA con 100 microlitri di soluzione di reagente di trasfezione e incubare per 20-45 minuti a temperatura ambiente.
Dividere e aggiungere 100.000 cellule MDCK o A549 in 800 microlitri del mezzo di coltura completo. Aggiungere 200 microlitri di complesso reagente di trasfezione siRNA e aggiungere questa sospensione a una piastra di coltura a 12 pozzetti. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius sotto un'atmosfera di anidride carbonica del 5% per 72 ore.
Infettare le cellule con il virus dell'influenza A, ma senza inibitori. Eseguire Western blotting e confrontare i livelli di proteine come mostrato in precedenza. Individuare i motivi di scissione delle caspasi XXXD e DXXD sul polipeptide.
Mutare l'acido aspartico P1, due acidi glutammici o alanina mediante mutagenesi sito-diretta e confermare mediante sequenziamento del DNA. In 100 microlitri di un mezzo appropriato, diluire due microgrammi di DNA plasmatico wild-type o mutante o volume raccomandato del reagente di trasfezione e incubare le provette per cinque minuti a temperatura ambiente. Mescolare 100 microlitri di soluzione di DNA plasmatico con 100 microlitri della soluzione di reagente di trasfezione e incubare per 20-45 minuti a temperatura ambiente.
Nel frattempo, dividere e aggiungere 300.000 cellule MDCK o A549 a 800 microlitri di terreno di coltura completo. Aggiungere 200 microlitri di complesso reagente di trasfezione del DNA e aggiungere questa sospensione a una piastra di coltura a 12 pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius sotto un'atmosfera di anidride carbonica del 5%.
Dopo 48 ore, infettare le cellule con il virus dell'influenza A senza inibitori. Eseguire Western blotting e confrontare i livelli di proteine come mostrato in precedenza. Utilizzando Western blotting, è stata valutata la degradazione della cortactina ospite da parte delle caspasi dell'ospite indotte dall'influenza.
Il trattamento delle cellule infette dal virus dell'influenza con un inibitore della caspasi-3 ha portato al salvataggio della cortactina e della degradazione virale delle NP. La quantificazione dell'intensità delle bande di cortactina e la sua normalizzazione con la corrispondente banda di actina ha mostrato che il livello di cortactina nelle cellule infette trattate con inibitore della caspasi-3 era più alto rispetto alle cellule infette non trattate. Nelle cellule impoverite di caspasi-6 o caspasi-7.
Non è stato osservato alcun recupero significativo dei livelli di polipeptide della cortactina, mentre nelle cellule impoverite della caspasi-3, la cortactina si è ripresa dalla degradazione indotta dal virus dell'influenza. La quantificazione e il confronto dei livelli di polipeptidi hanno mostrato che il livello di polipeptide della cortactina nelle cellule infette con espressione impoverita di caspasi-3 era superiore rispetto alle cellule con espressione normale di caspasi-3. La mutazione dell'acido aspartico in posizione 116 in acido glutammico ha reso il polipeptide della cortactina resistente alla degradazione indotta dal virus dell'influenza.
La quantificazione e il confronto dei livelli di polipeptidi hanno mostrato che il livello di polipeptide cortactina mutante nelle cellule infette era superiore a quello del polipeptide cortactina wild-type. È necessario generare decine di mutanti ed eseguire ripetute macchie occidentali per identificare il sito di scissione delle caspasi nel polipeptide. Un saggio biochimico in vitro contenente caspasi purificata e polipeptide bersaglio potrebbe essere sviluppato per confermare che la proteina di interesse è un substrato diretto a base di gas.
Questo protocollo aiuterà a comprendere il significato, la degradazione o la scissione della proteina bersaglio nel sistema che viene studiato, come l'infezione da virus o una malattia.
