שיטה זו תסייע לקבוע ולאשר אם חלבון בתאים נגועים בנגיף שפעת עובר השפלה או ביקוע על ידי caspases ולזהות את אתרי הבקיעה caspase. שיטה זו דורשת רק הגדרות מעבדה בסיסיות לביולוגיה מולקולרית ותאית ומיומנויות מחקר ואינה דורשת כל ציוד מיוחד או הכשרה בתוכנה. ניתן להתאים שיטה זו להשגת מטרות דומות הכוללות הדבקה בנגיפים או במיקרובים אחרים מן החי, וחשיפה לגירויים חיצוניים, כמו רעלנים וכימיקלים.
כדי להתחיל, זרע תאי MDCK או A549 בצלחת תרבית תאים של 12 באר. לדגור על התאים במשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% פחמן דו-חמצני. למחרת, הסר את מדיום התרבית הישן מהתאים ושטוף את התאים בכל באר פעמיים עם מיליליטר אחד של MEM ללא סרום.
לאחר מכן, להדביק את התאים על ידי הוספת 400 microliters של שפעת A וירוס inoculum, ומניחים את הצלחת עבור הדגירה במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, להסיר את הנגיף inoculum ולשטוף את התאים עם MEM. הוסף מיליליטר אחד של MEM ללא סרום לכל באר ודגירה של התאים כפי שמוצג בשלב הקודם.
לאחר 24 שעות, לקצור את התאים על ידי גירוד אותם עם בוכנה מזרק של מיליליטר אחד ולהעביר אותם צינור 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור ב 12, 000G במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר לאסוף את supernatant. לשטוף את כדור התא עם 250 microliters של מלח חוצץ פוספט צנטריפוגה.
הסר את supernatant ולהוסיף 100 microliters של מאגר תזה תאים. מערבבים לפי מערבולת. מחממים את הצינור ב 98 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי lyse לחלוטין את התאים.
לאחר מכן, פתור כמויות שוות של חלבון מדגימות לא נגועות ונגועות על ידי אלקטרופורזה סטנדרטית של ג'ל פוליאקרילאמיד SDS. לאחר אלקטרופורזה, מעבירים את ג'ל החלבון לקרום ניטרוצלולוז או PVDF ומבצעים כתם מערבי. השווה את רמות החלבון בנתיבי הדגימה הנגועים שטופלו במדומה ובמעכבים.
ב-100 מיקרוליטרים של מדיום מתאים, כמו Opti-MEM, מדללים 100 ננו-מולרים של בקרה או קספאז siRNA, או נפח מתאים של מגיב טרנספקציה. לדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מערבבים 100 מיקרוליטרים מכל תמיסת siRNA עם 100 מיקרוליטרים של תמיסת מגיב טרנספקציה ומדגרים במשך 20 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר.
לפצל ולהוסיף 100, 000 תאי MDCK או A549 ב 800 microliters של מדיום הצמיחה המלא. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של קומפלקס מגיבי טרנספקציה של siRNA והוסיפו את התרחיף הזה לצלחת תרבית של 12 בארות. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני במשך 72 שעות.
להדביק את התאים עם וירוס שפעת A, אבל ללא מעכבים. בצע כתם מערבי, והשווה את רמות החלבון כפי שהוצג קודם לכן. אתרו את מוטיבים המחשוף הקספאזי XXXD ו-DXXD על הפוליפפטיד.
מוטציה של חומצה אספרטית P1, שתי חומצות גלוטמיות, או אלנין על ידי מוטגנזה מכוונת אתר ואישור על ידי ריצוף DNA. ב-100 מיקרוליטרים של מדיום מתאים, יש לדלל שני מיקרוגרמים של דנ"א פלזמה מסוג בר או מוטציה או נפח מומלץ של מגיב הטרנספקציה ולדגירה של הצינורות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מערבבים 100 מיקרוליטרים של תמיסת DNA פלזמה עם 100 מיקרוליטרים של תמיסת מגיב הטרנספקציה ודוגרים במשך 20 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר.
בינתיים, לפצל ולהוסיף 300, 000 MDCK או A549 תאים ל 800 microliters של בינוני צמיחה מלאה. הוסף 200 מיקרוליטרים של קומפלקס מגיב טרנספקציה DNA והוסף את המתלה הזה לצלחת תרבית של 12 בארות. לדגום את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני.
לאחר 48 שעות, להדביק את התאים עם וירוס שפעת A ללא מעכבים. בצע כתם מערבי, והשווה את רמות החלבון כפי שהוצג קודם לכן. באמצעות הכתמה מערבית, הוערכה ההשפלה של קורטקטין מארח על ידי קספאזות פונדקאיות הנגרמות על ידי שפעת.
טיפול בתאים נגועים בנגיף השפעת עם מעכב קספאז-3 הביא להצלת קורטקטין ופירוק NP נגיפי. כימות עוצמת רצועות הקורטקטין והנורמליזציה שלו עם רצועת האקטין המתאימה הראו כי רמת הקורטקטין בתאים נגועים שטופלו במעכבי קספאז-3 הייתה גבוהה יותר בהשוואה לתאים נגועים שלא טופלו. בתאים מדולדלים של קספאז-6 או קספאז-7.
לא נצפתה התאוששות משמעותית ברמות הפוליפפטידים של קורטקטין, ואילו בתאים מדולדלים של קספאז-3, קורטקטין שהתאושש מנגיף השפעת גרם להתפרקות. כימות והשוואה של רמות הפוליפפטידים הראו כי רמת הפוליפפטיד של קורטקטין בתאים נגועים עם ביטוי קספאזי-3 מדולדל הייתה גבוהה יותר מאשר תאים עם ביטוי קספאז-3 רגיל. המוטציה של חומצה אספרטית בעמדה 116 לחומצה גלוטמית הפכה את הפוליפפטיד של הקורטקטין לעמיד בפני השפלה הנגרמת על ידי נגיף השפעת.
כימות והשוואה של רמות הפוליפפטידים הראו כי רמת הפוליפפטיד של קורטקטין מוטנטי בתאים נגועים הייתה גבוהה מזו של פוליפפטיד קורטקטין מסוג בר. הוא נדרש ליצור עשרות מוטנטים ולבצע כתמים מערביים חוזרים ונשנים כדי לזהות את אתר המחשוף הקספאזי בפוליפפטיד. ניתן לפתח בדיקה ביוכימית במבחנה המכילה קספאז מטוהר ופוליפפטיד מטרה כדי לאשר שהחלבון המעניין הוא מצע מבוסס גז ישיר.
פרוטוקול זה יסייע להבין את המשמעות, ההשפלה או הבקיעה של חלבון המטרה במערכת הנחקרת, כגון זיהום בנגיף או מחלה.
