Этот метод поможет определить и подтвердить, подвергается ли белок в инфицированных вирусом гриппом клетках деградации или расщеплению каспазами и идентифицировать места расщепления каспазы. Этот метод требует только базовых лабораторных условий молекулярной и клеточной биологии и исследовательских навыков и не требует какого-либо специализированного оборудования или обучения программному обеспечению. Этот метод может быть адаптирован для достижения аналогичных целей, связанных с инфекцией другими вирусами или микробами животных и воздействием внешних раздражителей, таких как токсины и химические вещества.
Для начала посейте клетки MDCK или A549 в 12-луночную пластину для культивирования клеток. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 градусах Цельсия в атмосфере углекислого газа 5%. На следующий день удалите из клеток старую культуральную среду и дважды промойте клетки в каждой лунке одним миллилитром mem без сыворотки.
Затем заражают клетки, добавляя 400 микролитров инокулятора вируса гриппа А, и помещают пластину для инкубации в течение одного часа. После инкубации удаляют вирусный инокулятив и промывают клетки МЭМ. Добавьте по одному миллилитру MEM без сыворотки в каждую лунку и инкубируйте клетки, как показано на предыдущем этапе.
Через 24 часа соберите клетки, соскоблив их с помощью одномиллилитрового шприцевого плунжера, и перенесите их в трубку размером 1,5 миллилитра. Центрифугируйте трубку при 12 000G в течение двух минут при комнатной температуре и соберите супернатант. Промыть ячейку гранулы 250 микролитрами фосфатно-буферного физиологического раствора и центрифуги.
Удалите супернатант и добавьте 100 микролитров буфера лизиса клеток. Перемешать вихрем. Нагревайте трубку при 98 градусах Цельсия в течение 10 минут, чтобы полностью лизировать клетки.
Затем рассасывают равное количество белка из неинфицированных и инфицированных образцов с помощью стандартного электрофореза полиакриламидного геля SDS. После электрофореза перенесите белковый гель на нитроцеллюлозную или PVDF-мембрану и выполните вестерн-блоттинг. Сравните уровни белка в полосах инфицированных образцов, обработанных имитацией и ингибиторами.
В 100 микролитрах соответствующей среды, такой как Opti-MEM, разбавляют 100 наномоляров контрольной или каспазной siRNA, или соответствующего объема трансфекционного реагента. Инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре. Смешайте 100 микролитров каждого раствора siRNA со 100 микролитрами раствора трансфекционного реагента и инкубируйте в течение 20-45 минут при комнатной температуре.
Разделите и добавьте 100 000 клеток MDCK или A549 в 800 микролитрах полной питательной среды. Добавьте 200 микролитров комплекса реагентов трансфекции siRNA и добавьте эту суспензию в 12-луночную культуральную пластину. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов цельсия в атмосфере с диоксидом углерода 5% в течение 72 часов.
Инфицировать клетки вирусом гриппа А, но без ингибиторов. Выполните вестерн-блоттинг и сравните уровни белка, как показано ранее. Найдите мотивы расщепления каспазы XXXD и DXXD на полипептиде.
Мутировать аспарагиновую кислоту P1, две глутаминные кислоты или аланин путем мутагенеза, направленного на сайт, и подтвердить секвенированием ДНК. В 100 микролитрах соответствующей среды развести два микрограмма ДНК дикой или мутантной плазмы или рекомендуемого объема трансфекционного реагента и инкубировать пробирки в течение пяти минут при комнатной температуре. Смешайте 100 микролитров плазменного раствора ДНК со 100 микролитрами раствора трансфекционного реагента и инкубируйте в течение 20-45 минут при комнатной температуре.
Тем временем разделите и добавьте 300 000 клеток MDCK или A549 к 800 микролитрам полной питательной среды. Добавьте 200 микролитров комплекса реагентов трансфекции ДНК и добавьте эту суспензию в 12-луночную культуральную пластину. Инкубируйте плиту при температуре 37 градусов цельсия в атмосфере углекислого газа 5%.
Через 48 часов заражают клетки вирусом гриппа А без ингибиторов. Выполните вестерн-блоттинг и сравните уровни белка, как показано ранее. Используя вестерн-блоттинг, оценивали деградацию кортактина хозяина каспазами хозяина, вызванными гриппом.
Лечение инфицированных вирусом гриппа клеток ингибитором каспазы-3 привело к спасению кортактина и вирусной деградации NP. Количественная оценка интенсивности кортактиновых полос и ее нормализация с соответствующей актиновой полосой показали, что уровень кортактина в инфицированных клетках, обработанных ингибитором каспазы-3, был выше по сравнению с необработанными инфицированными клетками. В каспазе-6 или каспазе-7 истощаются клетки.
Не наблюдалось значительного восстановления уровней полипептида кортактина, тогда как в клетках, обедненных каспазой-3, кортактин восстанавливался после деградации, вызванной вирусом гриппа. Количественная оценка и сравнение уровней полипептидов показали, что уровень полипептида кортактина в инфицированных клетках с истощенной экспрессией каспазы-3 был выше, чем в клетках с нормальной экспрессией каспазы-3. Мутация аспарагиновой кислоты в позиции 116 в глутаминовую кислоту сделала полипептид кортактина устойчивым к деградации, вызванной вирусом гриппа.
Количественная оценка и сравнение уровней полипептидов показали, что уровень мутантного полипептида кортактина в инфицированных клетках был выше, чем у полипептида кортактина дикого типа. Требуется генерировать десятки мутантов и выполнять повторное вестерн-блоттинг для идентификации места расщепления каспазы в полипептиде. Биохимический анализ in vitro, содержащий очищенную каспазу и целевой полипептид, может быть разработан для подтверждения того, что интересующий белок является прямым субстратом на газовой основе.
Этот протокол поможет понять значение, деградацию или расщепление белка-мишени в изучаемой системе, например, вирусную инфекцию или заболевание.
