Cette méthode aidera à déterminer et à confirmer si une protéine dans les cellules infectées par le virus de la grippe subit une dégradation ou un clivage par les caspases et à identifier les sites de clivage de la caspase. Cette méthode ne nécessite que des laboratoires de biologie moléculaire et cellulaire de base et des compétences en recherche et ne nécessite aucun équipement spécialisé ou formation logicielle. Cette méthode peut être adaptée pour atteindre des objectifs similaires impliquant l’infection par d’autres virus ou microbes animaux, et l’exposition à des stimuli externes, comme les toxines et les produits chimiques.
Pour commencer, ensemencez les cellules MDCK ou A549 dans une plaque de culture cellulaire à 12 puits. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius sous une atmosphère de dioxyde de carbone à 5%. Le lendemain, retirez l’ancien milieu de culture des cellules et lavez les cellules de chaque puits deux fois avec un millilitre de MEM sans sérum.
Ensuite, infectez les cellules en ajoutant 400 microlitres d’inoculum du virus de la grippe A et placez la plaque pour l’incubation pendant une heure. Après l’incubation, retirer l’inoculum du virus et laver les cellules avec MEM. Ajouter un millilitre de MEM sans sérum à chaque puits et incuber les cellules comme indiqué à l’étape précédente.
Après 24 heures, récoltez les cellules en les grattant avec un piston de seringue d’un millilitre et transférez-les dans un tube de 1,5 millilitre. Centrifuger le tube à 12 000G pendant deux minutes à température ambiante et recueillir le surnageant. Lavez la pastille cellulaire avec 250 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate et une centrifugeuse.
Retirez le surnageant et ajoutez 100 microlitres de tampon de lyse cellulaire. Mélanger par vortex. Chauffer le tube à 98 degrés Celsius pendant 10 minutes pour lyser complètement les cellules.
Ensuite, résolvez des quantités égales de protéines provenant d’échantillons non infectés et infectés par électrophorèse standard sur gel de polyacrylamide SDS. Après électrophorèse, transférer le gel de protéines sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF et effectuer le transfert Western. Comparez les niveaux de protéines dans les voies d’échantillonnage infectées traitées simulées et traitées par inhibiteur.
Dans 100 microlitres de milieu approprié, comme Opti-MEM, diluer 100 nanomolaires de contrôle ou de caspase siRNA, ou le volume approprié de réactif de transfection. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Mélanger 100 microlitres de chaque solution de siRNA avec 100 microlitres de solution de réactif de transfection et incuber pendant 20 à 45 minutes à température ambiante.
Divisez et ajoutez 100 000 cellules MDCK ou A549 dans 800 microlitres du milieu de croissance complet. Ajouter 200 microlitres de complexe de réactif de transfection siRNA et ajouter cette suspension à une plaque de culture de 12 puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius sous une atmosphère de dioxyde de carbone à 5% pendant 72 heures.
Infecter les cellules avec le virus de la grippe A, mais sans inhibiteurs. Effectuez le Western blot et comparez les niveaux de protéines comme indiqué précédemment. Repérez les motifs de clivage des caspases XXXD et DXXD sur le polypeptide.
Faire muter l’acide aspartique P1, deux acides glutamiques ou l’alanine par mutagénèse dirigée et confirmer par séquençage de l’ADN. Dans 100 microlitres d’un milieu approprié, diluer deux microgrammes d’ADN plasmatique de type sauvage ou mutant ou le volume recommandé du réactif de transfection et incuber les tubes pendant cinq minutes à température ambiante. Mélanger 100 microlitres de solution d’ADN plasmatique avec 100 microlitres de la solution de réactif de transfection et incuber pendant 20 à 45 minutes à température ambiante.
En attendant, divisez et ajoutez 300 000 cellules MDCK ou A549 à 800 microlitres de milieu de croissance complet. Ajouter 200 microlitres de complexe de réactif de transfection d’ADN et ajouter cette suspension à une plaque de culture de 12 puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius sous une atmosphère de dioxyde de carbone à 5%.
Après 48 heures, infectez les cellules avec le virus de la grippe A sans inhibiteurs. Effectuez le Western blot et comparez les niveaux de protéines comme indiqué précédemment. À l’aide du transfert Western, la dégradation de la cortactine de l’hôte par les caspases de l’hôte induites par la grippe a été évaluée.
Le traitement des cellules infectées par le virus de la grippe avec un inhibiteur de la caspase-3 a permis de sauver la dégradation de la cortactine et du NP viral. La quantification de l’intensité des bandes de cortactine et sa normalisation avec la bande d’actine correspondante ont montré que le niveau de cortactine dans les cellules infectées traitées par inhibiteur de la caspase-3 était plus élevé que dans les cellules infectées non traitées. Dans les cellules appauvries de la caspase-6 ou de la caspase-7.
Aucune récupération significative des taux de polypeptide de cortactine n’a été observée, tandis que dans les cellules appauvries en caspase-3, la cortactine récupérée de la dégradation induite par le virus de la grippe. La quantification et la comparaison des niveaux de polypeptides ont montré que le niveau de polypeptide de cortactine dans les cellules infectées avec une expression appauvrie de caspase-3 était plus élevé que dans les cellules avec une expression normale de caspase-3. La mutation de l’acide aspartique en position 116 en acide glutamique a rendu le polypeptide de cortactine résistant à la dégradation induite par le virus de la grippe.
La quantification et la comparaison des niveaux de polypeptides ont montré que le niveau de polypeptide de cortactine mutante dans les cellules infectées était supérieur à celui du polypeptide de cortactine de type sauvage. Il est nécessaire de générer des dizaines de mutants et d’effectuer des transferts Western répétés pour identifier le site de clivage de la caspase dans le polypeptide. Un essai biochimique in vitro contenant de la caspase purifiée et du polypeptide cible pourrait être mis au point pour confirmer que la protéine d’intérêt est un substrat direct à base de gaz.
Ce protocole aidera à comprendre l’importance, la dégradation ou le clivage de la protéine cible dans le système étudié, comme une infection virale ou une maladie.
