Diese Methode hilft zu bestimmen und zu bestätigen, ob ein Protein in mit Influenzaviren infizierten Zellen durch Caspasen abgebaut oder gespalten wird, und die Caspase-Spaltstellen zu identifizieren. Diese Methode erfordert nur grundlegende molekular- und zellbiologische Laboreinstellungen und Forschungsfähigkeiten und erfordert keine spezielle Ausrüstung oder Softwareschulung. Diese Methode kann angepasst werden, um ähnliche Ziele zu erreichen, die eine Infektion mit anderen tierischen Viren oder Mikroben und die Exposition gegenüber äußeren Reizen wie Toxinen und Chemikalien beinhalten.
Um zu beginnen, säen Sie MDCK- oder A549-Zellen in einer 12-Well-Zellkulturplatte. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius unter einer 5% Kohlendioxidatmosphäre. Am nächsten Tag das alte Kulturmedium aus den Zellen entfernen und die Zellen in jeder Vertiefung zweimal mit einem Milliliter serumfreiem MEM waschen.
Dann infizieren Sie die Zellen, indem Sie 400 Mikroliter Influenza-A-Virus-Inokulum hinzufügen und die Platte für eine Stunde zur Inkubation stellen. Entfernen Sie nach der Inkubation das Virusinokulum und waschen Sie die Zellen mit MEM. Fügen Sie einen Milliliter serumfreies MEM zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Zellen wie im vorherigen Schritt gezeigt.
Nach 24 Stunden ernten Sie die Zellen, indem Sie sie mit einem Ein-Milliliter-Spritzenkolben abkratzen und in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 12.000 G für zwei Minuten bei Raumtemperatur und sammeln Sie den Überstand. Waschen Sie das Zellpellet mit 250 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung und Zentrifuge.
Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 100 Mikroliter Zelllysepuffer hinzu. Mix nach Vortex. Erhitzen Sie das Röhrchen bei 98 Grad Celsius für 10 Minuten, um die Zellen vollständig zu lysieren.
Dann lösen Sie gleiche Mengen an Protein aus nicht infizierten und infizierten Proben durch Standard-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf. Nach der Elektrophorese das Proteingel auf eine Nitrocellulose- oder PVDF-Membran übertragen und Western Blotting durchführen. Vergleichen Sie die Proteinspiegel in den simuliert behandelten und inhibitorbehandelten infizierten Probenbahnen.
In 100 Mikrolitern geeignetem Medium, wie Opti-MEM, werden 100 Nanomolaren Kontroll- oder Caspase-siRNA oder ein geeignetes Volumen an Transfektionsreagenz verdünnt. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Mischen Sie 100 Mikroliter jeder siRNA-Lösung mit 100 Mikrolitern Transfektionsreagenzlösung und inkubieren Sie für 20 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur.
Teilen und fügen Sie 100.000 MDCK- oder A549-Zellen in 800 Mikroliter des gesamten Wachstumsmediums hinzu. Fügen Sie 200 Mikroliter siRNA-Transfektionsreagenzkomplex hinzu und geben Sie diese Suspension zu einer 12-Well-Kulturplatte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius unter einer 5% Kohlendioxidatmosphäre für 72 Stunden.
Infizieren Sie die Zellen mit Influenza-A-Virus, aber ohne Inhibitoren. Führen Sie Western Blotting durch und vergleichen Sie die Proteinspiegel wie zuvor gezeigt. Suchen Sie die Caspase-Spaltmotive XXXD und DXXD auf dem Polypeptid.
Mutieren Sie die P1-Asparaginsäure, zwei Glutaminsäuren oder Alanin durch ortsgerichtete Mutagenese und bestätigen Sie durch DNA-Sequenzierung. In 100 Mikrolitern eines geeigneten Mediums werden zwei Mikrogramm Wildtyp- oder mutierte Plasma-DNA oder das empfohlene Volumen des Transfektionsreagenz verdünnt und die Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Mischen Sie 100 Mikroliter Plasma-DNA-Lösung mit 100 Mikrolitern der Transfektionsreagenzlösung und inkubieren Sie für 20 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur.
In der Zwischenzeit teilen und 300, 000 MDCK- oder A549-Zellen zu 800 Mikrolitern komplettem Wachstumsmedium hinzufügen. Fügen Sie 200 Mikroliter DNA-Transfektionsreagenzkomplex hinzu und fügen Sie diese Suspension zu einer 12-Well-Kulturplatte hinzu. Die Platte bei 37 Grad Celsius unter einer 5%igen Kohlendioxidatmosphäre inkubieren.
Nach 48 Stunden infizieren Sie die Zellen mit dem Influenza-A-Virus ohne Inhibitoren. Führen Sie Western Blotting durch und vergleichen Sie die Proteinspiegel wie zuvor gezeigt. Mittels Western Blotting wurde der Abbau von Wirtscortactin durch Influenza-induzierte Wirtskaspasen untersucht.
Die Behandlung der mit dem Influenzavirus infizierten Zellen mit einem Caspase-3-Inhibitor führte zur Rettung von Cortactin und viralem NP-Abbau. Die Quantifizierung der Intensität der Cortactinbanden und deren Normalisierung mit der entsprechenden Aktinbande zeigte, dass der Cortactinspiegel in Caspase-3-Inhibitor-behandelten infizierten Zellen höher war als in unbehandelten infizierten Zellen. In Caspase-6 oder Caspase-7 erschöpften Zellen.
Es wurde keine signifikante Erholung der Cortactin-Polypeptidspiegel beobachtet, während sich Cortactin in Caspase-3-depletierten Zellen vom durch das Influenzavirus induzierten Abbau erholte. Die Quantifizierung und der Vergleich der Polypeptidspiegel zeigten, dass der Cortactin-Polypeptidspiegel in infizierten Zellen mit erschöpfter Caspase-3-Expression höher war als in Zellen mit normaler Caspase-3-Expression. Die Mutation von Asparaginsäure an Position 116 zu Glutaminsäure machte das Cortactin-Polypeptid resistent gegen den durch das Influenzavirus induzierten Abbau.
Die Quantifizierung und der Vergleich der Polypeptidspiegel zeigten, dass das Niveau des mutierten Cortactin-Polypeptids in infizierten Zellen höher war als das des Wildtyp-Cortactin-Polypeptids. Es ist erforderlich, Dutzende von Mutanten zu erzeugen und wiederholtes Western Blotting durchzuführen, um die Caspase-Spaltungsstelle im Polypeptid zu identifizieren. Ein biochemischer In-vitro-Assay, der gereinigte Caspase und Zielpolypeptid enthält, könnte entwickelt werden, um zu bestätigen, dass das interessierende Protein ein direktes substrat auf Gasbasis ist.
Dieses Protokoll wird helfen, die Bedeutung, den Abbau oder die Spaltung des Zielproteins in dem untersuchten System, wie z.B. eine Virusinfektion oder eine Krankheit, zu verstehen.
