Este método ayudará a determinar y confirmar si una proteína en las células infectadas por el virus de la influenza sufre degradación o escisión por caspasas e identificar los sitios de escisión de caspasas. Este método requiere solo entornos básicos de laboratorio de biología molecular y celular y habilidades de investigación y no requiere ningún equipo especializado o capacitación en software. Este método se puede adaptar para lograr objetivos similares que implican la infección con otros virus o microbios animales, y la exposición a estímulos externos, como toxinas y productos químicos.
Para comenzar, siembre células MDCK o A549 en una placa de cultivo celular de 12 pocillos. Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados bajo una atmósfera de dióxido de carbono al 5%. Al día siguiente, retire el medio de cultivo viejo de las células y lave las células en cada pocillo dos veces con un mililitro de MEM sin suero.
Luego, infecte las células agregando 400 microlitros de inóculo del virus de la influenza A y coloque la placa para la incubación durante una hora. Después de la incubación, retire el inóculo del virus y lave las células con MEM. Agregue un mililitro de MEM sin suero a cada pocillo e incube las células como se muestra en el paso anterior.
Después de 24 horas, cosecha las células raspándolas con un émbolo de jeringa de un mililitro y transfiérelas a un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo a 12, 000G durante dos minutos a temperatura ambiente y recoger el sobrenadante. Lave el pellet celular con 250 microlitros de solución salina tamponada con fosfato y centrífuga.
Retire el sobrenadante y agregue 100 microlitros de tampón de lisis celular. Mezclar por vórtice. Caliente el tubo a 98 grados centígrados durante 10 minutos para lisar completamente las células.
Luego, resuelva cantidades iguales de proteína de muestras no infectadas e infectadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS estándar. Después de la electroforesis, transfiera el gel de proteína a una membrana de nitrocelulosa o PVDF y realice Western blotting. Compare los niveles de proteína en los carriles de muestra infectados tratados con simulacros y tratados con inhibidores.
En 100 microlitros de medio apropiado, como Opti-MEM, diluir 100 nanomolares de control o caspasa siRNA, o volumen apropiado de reactivo de transfección. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Mezclar 100 microlitros de cada solución de ARNip con 100 microlitros de solución de reactivo de transfección e incubar durante 20 a 45 minutos a temperatura ambiente.
Divida y agregue 100, 000 células MDCK o A549 en 800 microlitros del medio de crecimiento completo. Agregue 200 microlitros de complejo de reactivos de transfección de ARNip y agregue esta suspensión a una placa de cultivo de 12 pocillos. Incubar las células a 37 grados centígrados bajo una atmósfera de dióxido de carbono al 5% durante 72 horas.
Infectar las células con el virus de la influenza A, pero sin inhibidores. Realice Western blot y compare los niveles de proteína como se mostró anteriormente. Localice los motivos de escisión de caspasa XXXD y DXXD en el polipéptido.
Mutar el ácido aspártico P1, dos ácidos glutámicos o alanina por mutagénesis dirigida al sitio y confirmar mediante secuenciación de ADN. En 100 microlitros de un medio apropiado, diluir dos microgramos de ADN plasmático de tipo salvaje o mutante o volumen recomendado del reactivo de transfección e incubar los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente. Mezclar 100 microlitros de solución de ADN plasmático con 100 microlitros de la solución de reactivo de transfección e incubar durante 20 a 45 minutos a temperatura ambiente.
Mientras tanto, divida y agregue 300, 000 células MDCK o A549 a 800 microlitros de medio de crecimiento completo. Agregue 200 microlitros de complejo de reactivo de transfección de ADN y agregue esta suspensión a una placa de cultivo de 12 pocillos. Incubar la placa a 37 grados centígrados bajo una atmósfera de dióxido de carbono al 5%.
Después de 48 horas, infecte las células con el virus de la influenza A sin inhibidores. Realice Western blot y compare los niveles de proteína como se mostró anteriormente. Usando Western blotting, se evaluó la degradación de la cortactina del huésped por caspasas del huésped inducidas por la influenza.
El tratamiento de las células infectadas por el virus de la influenza con un inhibidor de la caspasa-3 resultó en el rescate de la cortactina y la degradación viral de la NP. La cuantificación de la intensidad de las bandas de cortactina y su normalización con la banda de actina correspondiente mostró que el nivel de cortactina en las células infectadas tratadas con inhibidores de caspasa-3 era mayor en comparación con las células infectadas no tratadas. En células agotadas de caspasa-6 o caspasa-7.
No se observó una recuperación significativa en los niveles de polipéptido cortactina, mientras que en las células agotadas en caspasa-3, la cortactina se recuperó de la degradación inducida por el virus de la gripe. La cuantificación y comparación de los niveles de polipéptidos mostró que el nivel de polipéptido de cortactina en células infectadas con expresión de caspasa-3 agotada fue mayor que las células con expresión normal de caspasa-3. La mutación del ácido aspártico en la posición 116 a ácido glutámico hizo que el polipéptido cortactina fuera resistente a la degradación inducida por el virus de la gripe.
La cuantificación y comparación de los niveles de polipéptidos mostró que el nivel de polipéptido de cortactina mutante en las células infectadas era mayor que el del polipéptido de cortactina de tipo salvaje. Se requiere generar decenas de mutantes y realizar Western blot repetido para identificar el sitio de escisión de la caspasa en el polipéptido. Se podría desarrollar un ensayo bioquímico in vitro que contenga caspasa purificada y polipéptido objetivo para confirmar que la proteína de interés es un sustrato directo a base de gas.
Este protocolo ayudará a comprender la importancia, la degradación o la escisión de la proteína diana en el sistema que se está estudiando, como una infección por virus o una enfermedad.
