Bu yöntem, influenza virüsü ile enfekte olmuş hücrelerdeki bir proteinin kaspazlar tarafından bozulmaya veya bölünmeye uğrayıp uğramadığını belirlemeye ve doğrulamaya ve kaspaz bölünme bölgelerini tanımlamaya yardımcı olacaktır. Bu yöntem sadece temel moleküler ve hücresel biyoloji laboratuvar ortamlarını ve araştırma becerilerini gerektirir ve herhangi bir özel ekipman veya yazılım eğitimi gerektirmez. Bu yöntem, diğer hayvan virüsleri veya mikropları ile enfeksiyonu ve toksinler ve kimyasallar gibi dış uyaranlara maruz kalmayı içeren benzer hedeflere ulaşmak için uyarlanabilir.
Başlamak için, 12 kuyucuklu bir hücre kültürü plakasında MDCK veya A549 hücrelerini tohumlayın. Hücreleri% 5'lik bir karbondioksit atmosferi altında gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, eski kültür ortamını hücrelerden çıkarın ve her bir kuyucuktaki hücreleri bir mililitre serumsuz MEM ile iki kez yıkayın.
Daha sonra, 400 mikrolitre influenza A virüsü inokülü ekleyerek hücreleri enfekte edin ve plakayı bir saat boyunca inkübasyon için yerleştirin. Kuluçkadan sonra, virüs inokulumunu çıkarın ve hücreleri MEM ile yıkayın. Her bir kuyucuğa bir mililitre serumsuz MEM ekleyin ve hücreleri önceki adımda gösterildiği gibi inkübe edin.
24 saat sonra, hücreleri bir mililitrelik bir şırınga pistonuyla kazıyarak toplayın ve 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü oda sıcaklığında iki dakika boyunca 12.000G'de santrifüj yapın ve süpernatanı toplayın. Hücre peletini 250 mikrolitre fosfat tamponlu salin ve santrifüj ile yıkayın.
Süpernatantı çıkarın ve 100 mikrolitre hücre lizis tamponu ekleyin. Girdap ile karıştırın. Hücreleri tamamen lize etmek için tüpü 98 santigrat derecede 10 dakika ısıtın.
Daha sonra, enfekte olmamış ve enfekte olmuş numunelerden eşit miktarda proteini standart SDS poliakrilamid jel elektroforezi ile çözün. Elektroforezden sonra, protein jelini bir nitroselüloz veya PVDF membranına aktarın ve Batı lekelemesi yapın. Alay ile tedavi edilmiş ve inhibitör ile muamele edilmiş enfekte numune şeritlerindeki protein seviyelerini karşılaştırın.
Opti-MEM gibi 100 mikrolitre uygun ortamda, 100 nanomolar kontrol veya kaspaz siRNA veya uygun hacimde transfeksiyon reaktifi seyreltin. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Her siRNA çözeltisinin 100 mikrolitresini 100 mikrolitre transfeksiyon reaktif çözeltisi ile karıştırın ve oda sıcaklığında 20 ila 45 dakika inkübe edin.
Tam büyüme ortamının 800 mikrolitresine 100.000 MDCK veya A549 hücresini bölün ve ekleyin. 200 mikrolitre siRNA transfeksiyon reaktif kompleksi ekleyin ve bu süspansiyonu 12 delikli bir kültür plakasına ekleyin. Hücreleri 72 saat boyunca% 5'lik bir karbondioksit atmosferi altında 37 santigrat derecede inkübe edin.
Hücreleri influenza A virüsü ile enfekte edin, ancak inhibitörler olmadan. Batı lekelemesi yapın ve daha önce gösterildiği gibi protein seviyelerini karşılaştırın. Polipeptit üzerindeki XXXD ve DXXD kaspaz bölünme motiflerini bulun.
P1 aspartik asidi, iki glutamik asidi veya alanini bölgeye yönelik mutagenez ile mutasyona uğratın ve DNA dizilimi ile onaylayın. Uygun bir ortamın 100 mikrolitresinde, iki mikrogram vahşi tip veya mutant plazma DNA'sını veya transfeksiyon reaktifinin önerilen hacmini seyreltin ve tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. 100 mikrolitre plazma DNA çözeltisini 100 mikrolitre transfeksiyon reaktif çözeltisi ile karıştırın ve oda sıcaklığında 20 ila 45 dakika inkübe edin.
Bu arada, 800 mikrolitre tam büyüme ortamına 300.000 MDCK veya A549 hücresini bölün ve ekleyin. 200 mikrolitre DNA transfeksiyon reaktif kompleksi ekleyin ve bu süspansiyonu 12 delikli bir kültür plakasına ekleyin. Plakayı% 5'lik bir karbondioksit atmosferi altında 37 santigrat derecede inkübe edin.
48 saat sonra, hücreleri inhibitörler olmadan influenza A virüsü ile enfekte edin. Batı lekelemesi yapın ve daha önce gösterildiği gibi protein seviyelerini karşılaştırın. Western blotting kullanılarak, konakçı kortaktinin influenzaya bağlı konakçı kaspazları ile bozulması değerlendirildi.
İnfluenza virüsü ile enfekte olmuş hücrelerin bir kaspaz-3 inhibitörü ile tedavisi, kortaktin ve viral NP yıkımının kurtarılmasıyla sonuçlandı. Kortaktin bantlarının yoğunluğunun ölçülmesi ve karşılık gelen aktin bandı ile normalizasyonu, kaspaz-3 inhibitörü ile tedavi edilen enfekte hücrelerdeki kortaktin seviyesinin, tedavi edilmemiş enfekte hücrelere kıyasla daha yüksek olduğunu göstermiştir. Kaspaz-6 veya kaspaz-7 tükenmiş hücrelerde.
Kortaktin polipeptit düzeylerinde anlamlı bir iyileşme gözlenmezken, kaspaz-3 tükenmiş hücrelerde kortaktin, influenza virüsünün neden olduğu yıkımdan kurtuldu. Polipeptit düzeylerinin nicelleştirilmesi ve karşılaştırılması, tükenmiş kaspaz-3 ekspresyonuna sahip enfekte hücrelerde kortaktin polipeptit düzeyinin normal kaspaz-3 ekspresyonuna sahip hücrelerden daha yüksek olduğunu göstermiştir. Aspartik asidin 116 pozisyonunda glutamik aside mutasyonu, kortaktin polipeptitini influenza virüsünün neden olduğu bozunmaya dirençli hale getirmiştir.
Polipeptit düzeylerinin nicelleştirilmesi ve karşılaştırılması, enfekte hücrelerde mutant kortaktin polipeptit düzeyinin vahşi tip kortaktin polipeptitinden daha yüksek olduğunu göstermiştir. Polipeptitteki kaspaz bölünme bölgesini tanımlamak için onlarca mutant üretmek ve tekrarlanan Batı lekelenmesi yapmak gerekir. Saflaştırılmış kaspaz ve hedef polipeptit içeren bir in vitro biyokimyasal tahlil, ilgilenilen proteinin doğrudan gaz bazlı bir substrat olduğunu doğrulamak için geliştirilebilir.
Bu protokol, virüs enfeksiyonu veya bir hastalık gibi çalışılan sistemdeki hedef proteinin önemini, bozulmasını veya bölünmesini anlamaya yardımcı olacaktır.
