Наш протокол предоставляет конвейер как для точной интеграции, так и для простого визуального обнаружения изменений CRISPR, а также пример фенотипирования после редактирования. Основным преимуществом такого подхода является простота обнаружения редактирования CRISPR, что позволяет эффективно и упрощенно идентифицировать успешные правки. Такой подход позволяет легко генерировать и характеризовать связанные с заболеванием варианты у рыбок данио.
Здесь мы исследуем синдром удлиненного интервала QT. Последующие исследования по фармацевтической терапии затем можно изучить. Начните с разработки двух направляющих sgRNA для иссечения последовательности целевого сайта, идентифицируя ортолог рыбок данио для интересующего гена.
Используйте Ensembl для определения местоположения целевого участка в интересующей генной последовательности, включая двухкобазную фланговую последовательность, используемую для создания шаблона. Используйте программный инструмент проектирования, такой как CRISPOR, и выберите виды Danio rerio и фермент Cas. Для подхода с двумя сгРНК выберите одну sgRNA перед целевым экзоном и вторую sgRNA в непосредственном нисходящем интроне.
Убедитесь, что выбранные sgRNAs имеют высокую специфичность и низкое прогнозируемое нецелевое связывание. Используйте рейтинги CRISPOR для определения направляющих с минимальным нецелевым привязкой. Теперь определите наиболее вероятные потенциальные нецелевые участки для генотипирования секвенирования Сэнгера на основе ПЦР.
После выбора двух sgRNAs получите обратный комплемент для каждого, два комплементарных олиго, которые предшествуют мутации, и два комплементарных олиго после мутации. Добавьте совместимые рестрикционные сайты на каждом олиго, чтобы включить гид в плазмиду выбора. Для интеграции выбранных направляющих последовательностей в плазмиду DR274 создайте свес, используя пять основных участков ограничения BSA1, и спроектируйте сайты распознавания BSA1 на пяти основных концах направляющих.
Затем разработайте экзогенный шаблон для HDR у рыбок данио, выбрав два фрагмента последовательности, которые будут фланкировать M венозный ген репортера YFP, размещенный в плазмиде PKHR5. Разделите шаблон на два сегмента, чтобы вставить его по обе стороны от гена репортера M venous YFP. Убедитесь, что разделенный участок находится в интроне, чтобы избежать сокращения последовательности кодирования.
Включить все необходимые модификации, упомянутые в рукописи, чтобы облегчить клонирование в плазмиду PKHR5. Вводите эмбрионы на стадии одной клетки примерно через 40 минут после оплодотворения. После трех дней оплодотворения обезболивайте личинку рыбок данио, перенеся ее в 25-миллиметровую чашку Петри, содержащую 0,3% MS222, пока они не потеряют свой самовосстанавливающийся рефлекс.
После обезболивания перенесите личинку в колодец 24-луночной пластины. Используя микроскоп, способный обнаруживать GFP или YFP, экран для репортерной флуоресценции генов в глазах личинки. После захвата изображений личинки задокументируйте наличие или отсутствие экспрессии гена репортера.
Чтобы подтвердить точное и точное редактирование гена HDR, выполните генотипирование, сначала обезболив личинку через три дня после оплодотворения, как было продемонстрировано ранее, и выделив геномную ДНК из хвостового зажима с использованием метода hotshot. Добавьте иссеченный хвостовой зажим к 15 микролитрам 25 миллимолярного гидроксида натрия и инкубируйте его при 95 градусах Цельсия в течение 20 минут, затем нейтрализуйте 1,5 микролитрами трис соляной кислоты. Центрифуга в 13 800 раз G в течение 30 секунд и удержание супернатанта, содержащего извлеченную геномную ДНК.
Восстановите личинку в среде E3 и верните ее в жилищную систему, если предполагается дальнейшее исследование. Используя извлеченную геномную ДНК в качестве шаблона, выполните секвенирование Сэнгера на основе ПЦР целевых и потенциальных нецелевых участков. Убедитесь, что конструкция праймера на цели захватывает место мутации и ближайший сайт связывания sgRNA.
Разработайте отдельный праймер секвенирования для обнаружения перехода от вставленной гомологической руки и гена-мишени для подтверждения интеграции в интересующий ген. Разработайте учебники для упорядочения трех основных потенциальных нецелевых сайтов. Компилируйте генотипирование и вне цели, частоту сердечных сокращений, размеры перикарда, фенотипирование ЭКГ и репортерные генные данные, идентифицируемые для каждой рыбки данио.
Экспрессия гена венозного репортера YFP M наблюдалась на островах, выступая в качестве положительного репортера успешной интеграции шаблонов. Было обнаружено, что репортерные ген-положительные рыбы имеют точное редактирование G2A, которое вводит вариант R56Q в ZKCNH6A. Здесь показано измерение размеров перикарда как соотношения площади глаз.
Тенденция брадикардии с нарастающим отеком перикарда, связанная с нарушениями реполяризации сердца у рыбок данио, наблюдалась у личинок, отредактированных геном R56Q. Запись ЭКГ из сердца личинки рыбки данио через три дня после оплодотворения показана здесь. Наиболее важным аспектом этого подхода является проектирование направляющих, как это часто бывает в процедурах CRISPR.
Эффективные руководства необходимы для успешного редактирования CRISPR. Можно использовать альтернативные методы CRISPR, обеспечивающие большую точность или другие функциональные возможности. Кроме того, могут быть вставлены большие гены, такие как основной редакционный комплекс, обеспечивающий индуцируемую систему редактирования in vivo.
