تتم دراسة الببتيدات كجزيئات جديدة مضادة للفطريات. يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة الفعالية المضادة للفطريات ضد مسببات الأمراض الفطرية البشرية المبيضات البيض. توفر هذه التقنية بيانات كمية عن النشاط المضاد للفطريات مع تقليل الوقت التجريبي والنفايات البلاستيكية مقارنة بالطرق الأخرى التي تتطلب إنشاء أجار.
بالإضافة إلى اختبار النشاط ضد المبيضات البيض ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لاختبار النشاط ضد الخلايا الأخرى المكونة للخميرة واختبار نشاط العوامل المضادة للفطريات ذات الجزيئات الصغيرة ابدأ بتلقيح سلالة المبيضات البيض المرغوبة في 10 ملليلتر من مستخلص الخميرة السائلة - الببتون - سكر العنب ، أو وسط YPD ، في أنبوب استزراع. قم بتنمية الثقافة بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية و 230 دورة في الدقيقة على شاكر دوار. الاستزراع الفرعي للاستزراع الليلي ل C.albicans وينمو إلى كثافة بصرية تبلغ حوالي 1.0 إلى 1.2 عند طول موجة 600 نانومتر.
قم بإذابة كل ببتيد في ماء معقم وقم بتخفيفه إلى ضعف أعلى تركيز مرغوب فيه ، ثم أضف 40 ميكرولترا من محاليل مخزون الببتيد المرغوبة إلى البئر الأول من كل صف في صفيحة مستديرة القاع ذات 96 بئرا. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من الماء المعقم فائق النقاء إلى الأعمدة من 2 إلى 12 من الصفوف التي تحتوي على الببتيد. لتخفيف محاليل مخزون الببتيد بشكل متسلسل عبر اللوحة حتى العمود 10 ، انقل 20 ميكرولترا من العمود 1 إلى العمود 2 واخلطها عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
كرر عملية التخفيف حتى العمود 10 الذي سيحتوي على 40 ميكرولترا من محلول الببتيد عند تخفيف 1 إلى 512 لتركيز العمود 1. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بإزالة 20 ميكرولترا من محلول الببتيد من العمود 10 وتخلص منه. نقل ثقافة C.albicans الفرعية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 3،900 جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
قم بإزالة المادة الطافية عن طريق السحب أو الصب. أعد تعليق الحبيبات ب 1 ملليلتر من محلول فوسفات الصوديوم 2 مليمولار وانقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.7 ملليلتر. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي وتجاهل طاف.
مرة أخرى ، أعد تعليق الحبيبات في 1 ملليلتر من محلول فوسفات الصوديوم 2 ملليمولار واغسلها مرتين أخريين لترك الخلايا المغسولة في 1 ملليلتر من محلول فوسفات الصوديوم. حدد كثافة الخلية لمعلق الخلية المغسولة وقم بتخفيف المعلق إلى 5 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر في مخزن فوسفات الصوديوم 2 مليمولار. خذ معلق خلية C.albicans المخفف وأضف 20 ميكرولترا إلى الأعمدة من 1 إلى 10 والعمود 12 من كل صف ، ثم أضف 20 ميكرولترا من محلول فوسفات الصوديوم 2 مليمولار إلى العمود 11.
قم بتغطية اللوحة 1 وضعها في حاضنة عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بإعداد صفيحة استزراع جديدة مكونة من 96 بئرا لتحديد الصلاحية عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من YPD إلى جميع آبار اللوحة رقم 2 ، ثم إضافة 100 ميكرولتر من محلول فوسفات الصوديوم 2 مليمولار إلى جميع آبار الصفيحة 2. لتخفيف العينات في اللوحة 1 ، استرجع اللوحة 1 من الحاضنة ، وأضف 280 ميكرولترا من محلول فوسفات الصوديوم 1 مليمولار في كل بئر.
بعد خلط المحتويات جيدا مع ماصة ، انقل 8 ميكرولتر من اللوحة 1 إلى البئر المقابلة للوحة 2. بمجرد الانتهاء من ذلك ، ضع اللوحة المغطاة 2 على شاكر لوحة المعايرة الدقيقة عند 350 دورة في الدقيقة لمدة 17 ساعة عند 30 درجة مئوية. امزج جميع الآبار في اللوحة 2 عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ، مما يضمن إعادة تأهيل جميع الخلايا.
احصل على قراءات الكثافة الضوئية بطول موجة 600 نانومتر لكل بئر في اللوحة 2 باستخدام قارئ لوحة الامتصاص. رسم الانخفاض في الصلاحية كدالة لتركيز الببتيد لحساب نسبة تثبيط النمو وتحديد تأثير الببتيدات على نمو C.albicans. بعد احتضان الببتيدات بخلايا C.albicans ، تم قياس النشاط المضاد للفطريات باستخدام وحدات تشكيل المستعمرة ، أو طريقة عد CFU والبروتوكول الموصوف الذي يتضمن قياسات الكثافة الضوئية.
كانت البيانات التي تستخدم قراءات الكثافة الضوئية قابلة للتكرار بدرجة كبيرة كما يتضح من الانحرافات المعيارية الصغيرة للتكرارات. عند تنفيذ هذا البروتوكول ، حافظ على خلايا المبيضات البيض في شكل خميرة عن طريق احتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية لأن قياسات الكثافة الضوئية غير موثوقة في الخلايا الفطرية. سمحت كفاءة هذه الطريقة للباحثين بإجراء دراسات ثلاثية عالية على نشاط الببتيد عن طريق اختبار أعداد أكبر من الببتيدات وتركيزات الببتيد.
