ペプチドは、新規抗真菌分子として研究されています。このプロトコルは、ヒト真菌病原体カンジダアルビカンスに対する抗真菌効果を研究するために使用できます。この技術は、寒天上で作成する必要がある他の方法と比較して、実験時間とプラスチック廃棄物を削減しながら、抗真菌活性に関する定量的データを提供します。
カンジダ・アルビカンスに対する活性を試験することに加えて、このプロトコルは、他の酵母形成細胞に対する活性を試験し、小分子抗真菌剤の活性を試験するために使用することができる培養チューブ内の10ミリリットルの液体酵母エキス−ペプトン−デキストロース、またはYPD培地に所望のカンジダ・アルビカンス株を接種することから始める。ロータリーシェーカーで摂氏30度、230rpmで一晩培養します。C.albicansの一晩培養物を継代培養し、600ナノメートルの波長で約1.0〜1.2の光学密度に増殖させる。
各ペプチドを滅菌水に可溶化し、希望の最高濃度の2倍に希釈してから、40マイクロリットルの所望のペプチドストック溶液を丸底96ウェルプレートの各列の最初のウェルに加えます。次に、ペプチドを含む列の2〜12列に20マイクロリットルの滅菌超純水を加えます。プレート全体でカラム10までのペプチドストック溶液を連続希釈するには、カラム1からカラム2に20マイクロリットルを移し、上下にピペッティングして混合します。
カラム1の濃度を1対512に希釈して40マイクロリットルのペプチド溶液を含むカラム10まで希釈プロセスを繰り返します。完了したら、カラム10から20マイクロリットルのペプチド溶液を取り出し、廃棄します。C.albicans継代培養物を15ミリリットルの遠沈管に移し、室温で3分間3, 900gで遠心分離する。
ピペッティングまたはデカントによって上清を除去します。ペレットを1ミリリットルの2ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液で再懸濁し、懸濁液を1.7ミリリットルの遠沈管に移します。遠心分離によって細胞をペレット化し、上清を廃棄する。
再度、ペレットを1ミリリットルの2ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁し、さらに2回洗浄して、洗浄した細胞を1ミリリットルのリン酸ナトリウム緩衝液中に放置する。洗浄した細胞懸濁液の細胞密度を決定し、懸濁液を2ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液中で1ミリリットル当たり10〜5番目の細胞に5倍に希釈する。希釈したC.albicans細胞懸濁液を採取し、各行のカラム1〜10およびカラム12に20マイクロリットルを加え、次に20マイクロリットルの2ミリモルリン酸ナトリウムバッファーをカラム11に加えます。
プレート1を覆い、摂氏30度のインキュベーターに30分間入れます。プレート番号2のすべてのウェルに100マイクロリットルのYPDを添加し、次にプレート2のすべてのウェルに100マイクロリットルの2ミリモルリン酸ナトリウムバッファーを加えて生存率を定量するために、新しい96ウェル培養プレートを準備します。プレート1でサンプルを希釈するには、インキュベーターからプレート1を取り出し、各ウェルに280マイクロリットルの1ミリモルリン酸ナトリウムバッファーを追加します。
内容物ウェルをピペットで混合した後、プレート1からプレート2の対応するウェルに8マイクロリットルを移します。完了したら、カバー付きプレート2をマイクロタイタープレートシェーカーに350rpmで摂氏30度で17時間置きます。プレート2のすべてのウェルを上下にピペッティングして混合し、すべての細胞が再懸濁されていることを確認します。
吸光度プレートリーダーを用いて、プレート2の各ウェルについて600ナノメートルの波長での光学濃度測定値を得る。増殖阻害パーセンテージを計算し、C.albicansの成長に対するペプチドの効果を決定するために、ペプチド濃度の関数として生存率の低下をプロットします。ペプチドをC.albicans細胞と共にインキュベートした後、抗真菌活性を、コロニー形成単位、またはCFU計数法および光学密度測定を組み込んだ記載のプロトコールを用いて定量化した。
光学密度測定値を使用したデータは、反復の小さな標準偏差によって示されるように、再現性が高かった。このプロトコルを実行する際には、菌糸細胞では光学密度測定が信頼できないため、細胞を摂氏30度でインキュベートすることにより、カンジダ・アルビカンス細胞を酵母の形で維持します。この方法の効率により、研究者は、より多くのペプチドとペプチド濃度をテストすることにより、ペプチド活性に関する高いトリプル研究を実行することができました。
