Пептиды изучаются как новые противогрибковые молекулы. Этот протокол может быть использован для изучения противогрибковой эффективности против грибкового патогена человека Candida albicans. Этот метод предоставляет количественные данные о противогрибковой активности при одновременном сокращении времени эксперимента и пластиковых отходов по сравнению с другими методами, требующими создания на агаре.
В дополнение к тестированию активности против Candida albicans, этот протокол может быть использован для проверки активности против других дрожжеобразующих клеток и для проверки активности низкомолекулярных противогрибковых агентов Начните с инокуляции желаемого штамма Candida albicans в 10 миллилитров жидкого дрожжевого экстракта-пептид-декстрозы или YPD в культуральной пробирке. Выращивают культуру в течение ночи при 30 градусах Цельсия и 230 об/мин на ротационном шейкере. Субкультурируют ночную культуру C.albicans и вырастают до оптической плотности примерно от 1,0 до 1,2 на длине волны 600 нанометров.
Солюбилизируйте каждый пептид в стерильной воде и разбавьте его в два раза по сравнению с желаемой максимальной концентрацией, затем добавьте 40 микролитров желаемых растворов пептидов в первую лунку каждого ряда в 96-луночной пластине с круглым дном. Затем добавьте 20 микролитров стерильной сверхчистой воды в столбцы со 2 по 12 рядов, содержащих пептид. Чтобы последовательно разбавить исходные растворы пептидов по всей пластине до столбца 10, перенесите 20 микролитров из колонки 1 в колонку 2 и перемешайте пипеткой вверх и вниз.
Повторите процесс разбавления до колонки 10, которая будет содержать 40 микролитров раствора пептида при разведении 1 к 512 концентрации колонки 1. После этого удалите 20 микролитров раствора пептида из колонки 10 и выбросьте его. Перенесите субкультуру C.albicans в 15-миллилитровую центрифужную пробирку и центрифугу при 3 900 г в течение 3 минут при комнатной температуре.
Удалите надосадочную жидкость пипеткой или декантацией. Ресуспендируйте гранулу 1 миллилитром 2-миллимолярного буфера фосфата натрия и перенесите суспензию в центрифужную пробирку объемом 1,7 миллилитра. Гранулируйте клетки центрифугированием и выбросьте надосадочную жидкость.
Опять же, ресуспендируйте гранулы в 1 миллилитре 2-миллимолярного буфера фосфата натрия и промойте еще 2 раза, чтобы оставить промытые клетки в 1 миллилитре буфера фосфата натрия. Определите плотность ячеек промытой клеточной суспензии и разбавьте суспензию в 5 раз от 10 до 5-й ячейки на миллилитр в 2-миллимолярном буфере фосфата натрия. Возьмите разбавленную клеточную суспензию C.albicans и добавьте 20 микролитров в столбцы с 1 по 10 и столбец 12 каждой строки, затем добавьте 20 микролитров 2-миллимолярного буфера фосфата натрия в столбец 11.
Накройте пластину 1 и поместите ее в инкубатор при температуре 30 градусов Цельсия на 30 минут. Подготовьте новую культуральную пластину на 96 лунок для количественной оценки жизнеспособности, добавив 100 микролитров YPD во все лунки планшета No 2, затем добавьте 100 микролитров 2-миллимолярного буфера фосфата натрия во все лунки планшета 2. Чтобы разбавить образцы в планшете 1, извлеките планшет 1 из инкубатора и добавьте 280 микролитров 1-миллимолярного буфера фосфата натрия в каждую лунку.
Хорошо перемешав содержимое пипеткой, перелейте 8 микролитров из пластины 1 в соответствующую лунку пластины 2. После этого поместите закрытую пластину 2 на шейкер для микротитрования при 350 об/мин на 17 часов при 30 градусах Цельсия. Перемешайте все лунки в пластине 2, пипеткой вверх и вниз, убедившись, что все ячейки ресуспендированы.
Получите показания оптической плотности на длине волны 600 нанометров для каждой скважины на пластине 2 с помощью считывателя пластин поглощения. Постройте график снижения жизнеспособности в зависимости от концентрации пептида, чтобы рассчитать процент ингибирования роста и определить влияние пептидов на рост C.albicans. После инкубации пептидов с клетками C.albicans противогрибковую активность количественно определяли с использованием колониеобразующих единиц или метода подсчета КОЕ и описанного протокола, включающего измерения оптической плотности.
Данные с использованием показаний оптической плотности были высоко воспроизводимыми, о чем свидетельствуют небольшие стандартные отклонения реплик. При выполнении этого протокола поддерживайте клетки Candida albicans в форме дрожжей, инкубируя клетки при 30 градусах Цельсия, поскольку измерения оптической плотности в гифальных клетках ненадежны. Эффективность этого метода позволила исследователям провести высокие тройные исследования пептидной активности путем тестирования большего количества пептидов и концентраций пептидов.
