定量肽对白色念珠菌的抗真菌活性

肽正在作为新型抗真菌分子进行研究。该协议可用于研究对人类真菌病原体白色念珠菌的抗真菌功效。该技术提供了抗真菌活性的定量数据，同时与需要在琼脂上创建的其他方法相比，减少了实验时间和塑料浪费。

除了测试针对白色念珠菌的活性外，该协议还可用于测试针对其他酵母形成细胞的活性并测试小分子抗真菌剂的活性首先将所需的白色念珠菌菌株接种到培养管中的10毫升液体酵母提取物 - 蛋白胨 - 葡萄糖或YPD培养基中。在旋转摇床上以 30 摄氏度和 230 rpm 的速度培养培养过夜。传代培养白色念珠菌的过夜培养物，并在600纳米波长下生长至约1.0至1.2的光密度。

将每种肽溶解在无菌水中并将其稀释至所需最高浓度的两倍，然后将40微升所需的肽储备溶液添加到圆底96孔板中每行的第一孔中。接下来，向含有肽的行的第2至12列中加入20微升无菌超纯水。要将肽储备溶液连续稀释到板中至第10列，请将20微升从第1列转移到第2列，并通过上下移液进行混合。

重复稀释过程直至第10列，该色谱柱将含有40微升肽溶液，稀释度为1至512。完成后，从第 10 列中取出 20 微升肽溶液并丢弃。将白色念珠菌传代培养物转移到15毫升离心管中，并在室温下以3， 900g离心3分钟。

通过移液或倾析除去上清液。用1毫升2毫摩尔磷酸钠缓冲液重悬沉淀，并将悬浮液转移到1.7毫升离心管中。通过离心沉淀细胞并丢弃上清液。

再次，将沉淀重悬于1毫升2毫摩尔磷酸钠缓冲液中，再洗涤2次，将洗涤的细胞留在1毫升磷酸钠缓冲液中。确定洗涤细胞悬液的细胞密度，并在2毫摩尔磷酸钠缓冲液中将悬浮液稀释至每毫升5乘以10至第5个细胞。取稀释的白色念珠菌细胞悬液，每行的第1至10列和第12列中加入20微升，然后在第11列中加入20微摩尔的2毫摩尔磷酸钠缓冲液。

盖上板1并将其放入30摄氏度的培养箱中30分钟。准备一个新的 96 孔培养板以量化活力，方法是向 2 号板的所有孔中加入 100 微升 YPD，然后将 100 微升 2 毫摩尔磷酸钠缓冲液添加到板 2 的所有孔中。要稀释板1中的样品，请从培养箱中取出板1，并在每个孔中加入280微升1毫摩尔磷酸钠缓冲液。

用移液管充分混合内容物后，将8微升从板1转移到板2的相应孔中。完成后，将覆盖的板 2 放在微量滴定板振荡器上，在 350 rpm 下在 30 摄氏度下放置 17 小时。通过上下移液混合板2中的所有孔，确保所有细胞都重新悬浮。

使用吸光度读板器获得板2中每个孔的600纳米波长的光密度读数。将活力降低绘制为肽浓度的函数，以计算生长抑制百分比并确定肽对白色念珠菌生长的影响。将肽与白色念珠菌细胞孵育后，使用集落形成单位或CFU计数方法和结合光密度测量的所述方案定量抗真菌活性。

使用光密度读数的数据具有高度可重复性，如重复的小标准偏差所示。在执行此协议时，通过在30摄氏度下孵育细胞来保持酵母形式的白色念珠菌细胞，因为光密度测量在菌丝细胞中不可靠。这种方法的效率使研究人员能够通过测试更多的肽和肽浓度来对肽活性进行高三重研究。