Les peptides sont étudiés en tant que nouvelles molécules antifongiques. Ce protocole peut être utilisé pour étudier l’efficacité antifongique contre l’agent pathogène fongique humain Candida albicans. Cette technique fournit des données quantitatives sur l’activité antifongique tout en réduisant le temps expérimental et les déchets plastiques par rapport aux autres méthodes qui nécessitent la création sur agar.
En plus de tester l’activité contre Candida albicans, ce protocole peut être utilisé pour tester l’activité contre d’autres cellules formant des levures et pour tester l’activité d’agents antifongiques à petites molécules. Commencez par inoculer la souche désirée de Candida albicans dans 10 millilitres d’extrait liquide de levure-peptone-dextrose, ou milieu YPD, dans un tube de culture. Cultivez la culture pendant la nuit à 30 degrés Celsius et 230 tr / min sur un agitateur rotatif. Sous-culture de C. albicans et atteindre une densité optique d’environ 1,0 à 1,2 à une longueur d’onde de 600 nanomètres.
Solubiliser chaque peptide dans de l’eau stérile et le diluer jusqu’à deux fois la concentration la plus élevée souhaitée, puis ajouter 40 microlitres des solutions mères de peptides souhaitées au premier puits de chaque rangée dans une plaque à fond rond de 96 puits. Ensuite, ajoutez 20 microlitres d’eau stérile ultra-pure aux colonnes 2 à 12 des rangées contenant le peptide. Pour diluer en série les solutions mères de peptides sur la plaque jusqu’à la colonne 10, transférer 20 microlitres de la colonne 1 à la colonne 2 et mélanger en pipetant de haut en bas.
Répéter le processus de dilution jusqu’à la colonne 10 qui contiendra 40 microlitres de solution peptidique à une dilution de 1 à 512 de la concentration de la colonne 1. Une fois cela fait, retirez 20 microlitres de solution peptidique de la colonne 10 et jetez-la. Transférer la sous-culture de C. albicans dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et centrifuger à 3 900 g pendant 3 minutes à température ambiante.
Retirer le surnageant par pipetage ou décantation. Remettez la pastille en suspension avec 1 millilitre de tampon phosphate de sodium 2 millimolaires et transférez la suspension dans un tube centrifuge de 1,7 millilitre. Enduire les cellules par centrifugation et jeter le surnageant.
Encore une fois, remettez la pastille en suspension dans 1 millilitre de tampon de phosphate de sodium 2 millimolaires et lavez 2 fois de plus pour laisser les cellules lavées dans 1 millilitre de tampon phosphate de sodium. Déterminer la densité cellulaire de la suspension cellulaire lavée et diluer la suspension à 5 fois 10 à 5 cellules par millilitre dans un tampon de phosphate de sodium 2 millimolaires. Prélever la suspension cellulaire diluée de C. albicans et ajouter 20 microlitres aux colonnes 1 à 10 et à la colonne 12 de chaque rangée, puis ajouter 20 microlitres de tampon phosphate de sodium 2 millimolaires à la colonne 11.
Couvrir la plaque 1 et la placer dans un incubateur à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Préparer une nouvelle plaque de culture de 96 puits pour quantifier la viabilité en ajoutant 100 microlitres de YPD à tous les puits de la plaque numéro 2, puis ajouter 100 microlitres de tampon de phosphate de sodium 2 millimolaires à tous les puits de la plaque 2. Pour diluer les échantillons dans la plaque 1, récupérez la plaque 1 de l’incubateur et ajoutez 280 microlitres de tampon de phosphate de sodium 1 millimolaire dans chaque puits.
Après avoir bien mélangé le contenu avec une pipette, transférer 8 microlitres de la plaque 1 au puits correspondant de la plaque 2. Une fois cela fait, placez la plaque couverte 2 sur un agitateur à plaque de microtitrage à 350 tr / min pendant 17 heures à 30 degrés Celsius. Mélanger tous les puits de la plaque 2 en tuytant de haut en bas, en veillant à ce que toutes les cellules soient remises en suspension.
Obtenir des lectures de densité optique à une longueur d’onde de 600 nanomètres pour chaque puits de la plaque 2 à l’aide d’un lecteur de plaque absorbante. Tracer la réduction de la viabilité en fonction de la concentration peptidique pour calculer le pourcentage d’inhibition de la croissance et déterminer l’effet des peptides sur la croissance de C. albicans. Après incubation des peptides avec les cellules de C. albicans, l’activité antifongique a été quantifiée à l’aide des unités formant colonies, ou méthode de comptage CFU et du protocole décrit incorporant des mesures de densité optique.
Les données utilisant les lectures de densité optique étaient hautement reproductibles, comme l’indiquent les petits écarts-types des répétitions. En effectuant ce protocole, maintenir les cellules de Candida albicans sous forme de levure en incubant les cellules à 30 degrés Celsius, car les mesures de densité optique ne sont pas fiables dans les cellules hyphes. L’efficacité de cette méthode a permis aux chercheurs d’effectuer des études triples élevées sur l’activité peptidique en testant un plus grand nombre de peptides et des concentrations de peptides.
