Os peptídeos estão sendo estudados como novas moléculas antifúngicas. Este protocolo pode ser usado para estudar a eficácia antifúngica contra o patógeno fúngico humano Candida albicans. Esta técnica fornece dados quantitativos sobre a atividade antifúngica, reduzindo o tempo experimental e o desperdício de plástico em comparação com os outros métodos que exigem a criação no ágar.
Além de testar a atividade contra Candida albicans, este protocolo pode ser usado para testar a atividade contra outras células formadoras de levedura e para testar a atividade de agentes antifúngicos de moléculas pequenas Comece inoculando a cepa desejada de Candida albicans em 10 mililitros de extrato de levedura líquida-peptona-dextrose, ou meio YPD, em um tubo de cultura. Cultive a cultura durante a noite a 30 graus Celsius e 230 rpm em um agitador rotativo. Subcultura a cultura noturna de C.albicans e crescer para uma densidade óptica de aproximadamente 1,0 a 1,2 a 600 nanômetros de comprimento de onda.
Solubilize cada peptídeo em água estéril e dilua-o para o dobro da concentração mais alta desejada, em seguida, adicione 40 microlitros das soluções de estoque de peptídeos desejadas ao primeiro poço de cada linha em uma placa de 96 poços de fundo redondo. Em seguida, adicione 20 microlitros de água ultrapura estéril às colunas 2 a 12 das linhas que contêm o peptídeo. Para diluir em série as soluções-estoque de peptídeos em toda a placa até a coluna 10, transfira 20 microlitros da coluna 1 para a coluna 2 e misture-as pipetando para cima e para baixo.
Repetir o processo de diluição até à coluna 10, que conterá 40 microlitros de solução peptídica a uma diluição de 1 a 512 da concentração da coluna 1. Uma vez feito, remova 20 microlitros de solução peptídica da coluna 10 e descarte-o. Transfira a subcultura de C.albicans para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrífuga a 3.900 g por 3 minutos à temperatura ambiente.
Remova o sobrenadante por pipetagem ou decantação. Ressuspeite o pellet com 1 mililitro de tampão fosfato de sódio 2 milimolares e transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 1,7 mililitro. Pellet as células por centrifugação e descarte o sobrenadante.
Novamente, ressuspenda o pellet em 1 mililitro de tampão fosfato de sódio 2-milimolar e lave mais 2 vezes para deixar as células lavadas em 1 mililitro de tampão fosfato de sódio. Determinar a densidade celular da suspensão de células lavadas e diluir a suspensão para 5 vezes 10 a 5ª células por mililitro em um tampão de fosfato de sódio 2-milimolar. Tomar suspensão de células de C.albicans diluída e adicionar 20 microlitros às colunas 1 a 10 e à coluna 12 de cada linha, em seguida, adicionar 20 microlitros de tampão fosfato de sódio 2 milimolares à coluna 11.
Cubra a placa 1 e coloque-a em uma incubadora a 30 graus Celsius por 30 minutos. Prepare uma nova placa de cultura de 96 poços para quantificar a viabilidade adicionando 100 microlitros de YPD a todos os poços da placa número 2 e, em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de fosfato de sódio 2 milimolares a todos os poços da placa 2. Para diluir as amostras na placa 1, recupere a placa 1 da incubadora e adicione 280 microlitros de tampão fosfato de sódio 1-milimolar em cada poço.
Depois de misturar bem o conteúdo com uma pipeta, transfira 8 microlitros da placa 1 para o poço correspondente da placa 2. Uma vez feito, coloque a placa coberta 2 em um agitador de placa de microtitulação a 350 rpm por 17 horas a 30 graus Celsius. Misture todos os poços na placa 2 pipetando para cima e para baixo, garantindo que todas as células sejam ressuspensas.
Obter leituras de densidade óptica em um comprimento de onda de 600 nanômetros para cada poço na placa 2 usando um leitor de placa de absorbância. Plotar a redução da viabilidade em função da concentração de péptidos para calcular a percentagem de inibição do crescimento e determinar o efeito dos péptidos no crescimento de C.albicans. Após incubação dos peptídeos com as células de C.albicans, a atividade antifúngica foi quantificada utilizando-se o método de unidades formadoras de colônias, ou CFU e o protocolo descrito incorporando medidas de densidade óptica.
Os dados utilizados pelas leituras de densidade óptica foram altamente reprodutíveis, conforme indicado pelos pequenos desvios-padrão das repetições. Ao realizar este protocolo, mantenha as células de Candida albicans na forma de levedura incubando as células a 30 graus Celsius, uma vez que as medições de densidade óptica não são confiáveis nas células hifais. A eficiência deste método permitiu que os pesquisadores realizassem altos estudos triplos sobre a atividade peptídica, testando um número maior de peptídeos e concentrações de peptídeos.
