Los péptidos se están estudiando como nuevas moléculas antifúngicas. Este protocolo se puede utilizar para estudiar la eficacia antifúngica contra el patógeno fúngico humano Candida albicans. Esta técnica proporciona datos cuantitativos sobre la actividad antifúngica al tiempo que reduce el tiempo experimental y los desechos plásticos en comparación con los otros métodos que requieren la creación en agar.
Además de probar la actividad contra Candida albicans, este protocolo se puede utilizar para probar la actividad contra otras células formadoras de levadura y para probar la actividad de agentes antifúngicos de moléculas pequeñas Comience por inocular la cepa deseada de Candida albicans en 10 mililitros de extracto de levadura líquida-peptona-dextrosa, o medio YPD, en un tubo de cultivo. Cultive el cultivo durante la noche a 30 grados centígrados y 230 rpm en un agitador rotativo. Subcultivo El cultivo nocturno de C.albicans y crecer a una densidad óptica de aproximadamente 1.0 a 1.2 a 600 nanómetros de longitud de onda.
Solubilice cada péptido en agua estéril y dilúyalo al doble de la concentración más alta deseada, luego agregue 40 microlitros de las soluciones madre de péptidos deseadas al primer pocillo de cada fila en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. A continuación, agregue 20 microlitros de agua ultrapura estéril a las columnas 2 a 12 de las filas que contienen el péptido. Para diluir en serie las soluciones madre de péptidos a través de la placa hasta la columna 10, transfiera 20 microlitros de la columna 1 a la columna 2 y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
Repita el proceso de dilución hasta la columna 10, que contendrá 40 microlitros de solución peptídica en una dilución de 1 a 512 de la concentración de la columna 1. Una vez hecho esto, retire 20 microlitros de solución peptídica de la columna 10 y deséchela. Transfiera el subcultivo de C.albicans a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y centrifugar a 3, 900 g durante 3 minutos a temperatura ambiente.
Retirar el sobrenadante mediante pipeteo o decantación. Vuelva a suspender el pellet con 1 mililitro de tampón de fosfato de sodio de 2 milimolares y transfiera la suspensión a un tubo de centrífuga de 1,7 mililitros. Granular las células centrifugando y desechar el sobrenadante.
Nuevamente, resuspenda el pellet en 1 mililitro de tampón fosfato de sodio 2-milimolar y lave 2 veces más para dejar las celdas lavadas en 1 mililitro de tampón fosfato de sodio. Determine la densidad celular de la suspensión de células lavadas y diluya la suspensión de 5 veces 10 a la quinta celda por mililitro en un tampón de fosfato de sodio de 2 milimolares. Tome la suspensión celular C.albicans diluida y agregue 20 microlitros a las columnas 1 a 10 y a la columna 12 de cada fila, luego agregue 20 microlitros de tampón de fosfato de sodio 2 milimolar a la columna 11.
Cubra la placa 1 y colóquela en una incubadora a 30 grados centígrados durante 30 minutos. Prepare una nueva placa de cultivo de 96 pocillos para cuantificar la viabilidad agregando 100 microlitros de YPD a todos los pocillos de la placa número 2, luego agregue 100 microlitros de tampón de fosfato de sodio 2-milimolar a todos los pocillos de la placa 2. Para diluir las muestras en la placa 1, recupere la placa 1 de la incubadora y agregue 280 microlitros de tampón de fosfato de sodio 1 milimolar en cada pozo.
Después de mezclar bien el contenido con una pipeta, transfiera 8 microlitros de la placa 1 al pocillo correspondiente de la placa 2. Una vez hecho esto, coloque la placa cubierta 2 en un agitador de placas de microtitulación a 350 rpm durante 17 horas a 30 grados centígrados. Mezcle todos los pocillos en la placa 2 pipeteando hacia arriba y hacia abajo, asegurando que todas las celdas estén resuspendidas.
Obtenga lecturas de densidad óptica a una longitud de onda de 600 nanómetros para cada pocillo en la placa 2 utilizando un lector de placas de absorbancia. Trazar la reducción de la viabilidad en función de la concentración de péptidos para calcular el porcentaje de inhibición del crecimiento y determinar el efecto de los péptidos sobre el crecimiento de C.albicans. Después de incubar los péptidos con las células de C.albicans, la actividad antifúngica se cuantificó utilizando las unidades formadoras de colonias, o método de conteo de UFC y el protocolo descrito incorporando mediciones de densidad óptica.
Los datos que utilizaron las lecturas de densidad óptica fueron altamente reproducibles, como lo indican las pequeñas desviaciones estándar de las réplicas. Al realizar este protocolo, mantenga las células de Candida albicans en forma de levadura incubando las células a 30 grados centígrados, ya que las mediciones de densidad óptica no son confiables en las células hifales. La eficiencia de este método ha permitido a los investigadores realizar estudios triples sobre la actividad peptídica mediante la prueba de un mayor número de péptidos y concentraciones de péptidos.
