Peptitler yeni antifungal moleküller olarak incelenmektedir. Bu protokol, insan mantar patojeni Candida albicans'a karşı antifungal etkinliği incelemek için kullanılabilir. Bu teknik, agar üzerinde oluşturulmasını gerektiren diğer yöntemlere kıyasla deneysel zamanı ve plastik atıkları azaltırken, antifungal aktivite hakkında nicel veriler sağlar.
Candida albicans'a karşı aktiviteyi test etmenin yanı sıra, bu protokol aktiviteyi diğer maya oluşturan hücrelere karşı test etmek ve küçük moleküllü antifungal ajanların aktivitesini test etmek için kullanılabilir İstenilen Candida albicans suşunu bir kültür tüpünde 10 mililitre sıvı maya ekstraktı-pepton-dekstroz veya YPD ortamına aşılayarak başlayın. Kültürü bir gecede 30 santigrat derece ve döner bir çalkalayıcıda 230 rpm'de büyütün. Alt kültür, C.albicans'ın gece kültürüdür ve 600 nanometre dalga boyunda yaklaşık 1.0 ila 1.2 optik yoğunluğa kadar büyür.
Her peptidi steril suda çözündürün ve istenen en yüksek konsantrasyonun iki katına kadar seyreltin, ardından yuvarlak tabanlı 96 delikli bir plakada her sıranın ilk kuyucuğuna istenen peptid stok çözeltilerinden 40 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, peptidi içeren sıraların 2 ila 12. sütunlarına 20 mikrolitre steril ultra saf su ekleyin. Peptit stok çözeltilerini plaka boyunca sütun 10'a kadar seri olarak seyreltmek için, sütun 1'den sütun 2'ye 20 mikrolitre aktarın ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
Seyreltme işlemini, sütun 1 konsantrasyonunun 1 ila 512 seyreltilmesinde 40 mikrolitre peptit çözeltisi içerecek olan sütun 10'a kadar tekrarlayın. İşiniz bittiğinde, sütun 10'dan 20 mikrolitre peptit çözeltisi çıkarın ve atın. C.albicans alt kültürünü 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 3.900 g'da santrifüj yapın.
Süpernatantı pipetleme veya dekantlama ile çıkarın. Peleti 1 mililitre 2 milimolar sodyum fosfat tamponu ile yeniden askıya alın ve süspansiyonu 1.7 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri santrifüj ederek toplayın ve süpernatanı atın.
Yine, peleti 1 mililitre 2 milimolar sodyum fosfat tamponunda yeniden askıya alın ve yıkanmış hücreleri 1 mililitre sodyum fosfat tamponunda bırakmak için 2 kez daha yıkayın. Yıkanmış hücre süspansiyonunun hücre yoğunluğunu belirleyin ve süspansiyonu 2 milimolar sodyum fosfat tamponunda mililitre başına 5. hücrelere 5 kat 10 ila 5. hücrelere seyreltin. Seyreltilmiş C.albicans hücre süspansiyonunu alın ve her sıranın 1 ila 10 numaralı sütunlarına ve 12. sütunlarına 20 mikrolitre ekleyin, ardından sütun 11'e 20 mikrolitre 2 milimolar sodyum fosfat tamponu ekleyin.
Kapak plakası 1'i kapatın ve 30 dakika boyunca 30 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. 2 numaralı plakanın tüm kuyularına 100 mikrolitre YPD ekleyerek canlılığı ölçmek için yeni bir 96 delikli kültür plakası hazırlayın, ardından plaka 2'nin tüm kuyularına 100 mikrolitre 2 milimolar sodyum fosfat tamponu ekleyin. Numuneleri plaka 1'de seyreltmek için, inkübatörden plaka 1'i alın ve her bir kuyucuğa 280 mikrolitre 1 milimolar sodyum fosfat tamponu ekleyin.
İçeriği bir pipetle iyice karıştırdıktan sonra, 8 mikrolitreyi plaka 1'den plaka 2'nin karşılık gelen kuyucuğuna aktarın. İşiniz bittiğinde, kapalı plaka 2'yi 30 santigrat derecede 17 saat boyunca 350 rpm'de bir mikrotitre plaka çalkalayıcıya yerleştirin. Plaka 2'deki tüm kuyucukları yukarı ve aşağı pipetleyerek, tüm hücrelerin yeniden askıya alındığından emin olarak karıştırın.
Bir absorbans plakası okuyucu kullanarak plaka 2'deki her kuyucuk için 600 nanometre dalga boyunda optik yoğunluk okumaları elde edin. Büyüme inhibisyon yüzdesini hesaplamak ve peptitlerin C.albicans büyümesi üzerindeki etkisini belirlemek için peptid konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak canlılıktaki azalmayı çizin. Peptitleri C.albicans hücreleri ile inkübe ettikten sonra, antifungal aktivite, koloni oluşturan birimler veya CFU sayma yöntemi ve optik yoğunluk ölçümlerini içeren tarif edilen protokol kullanılarak ölçüldü.
Optik yoğunluk okumalarını kullanan veriler, replikaların küçük standart sapmaları ile gösterildiği gibi yüksek oranda tekrarlanabilirdi. Bu protokolü uygularken, optik yoğunluk ölçümleri hifal hücrelerinde güvenilir olmadığından, hücreleri 30 santigrat derecede inkübe ederek Candida albicans hücrelerini maya formunda tutun. Bu yöntemin etkinliği, araştırmacıların daha fazla sayıda peptit ve peptit konsantrasyonunu test ederek peptid aktivitesi üzerinde yüksek üçlü çalışmalar yapmalarını sağlamıştır.
