I peptidi sono in fase di studio come nuove molecole antifungine. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare l'efficacia antifungina contro il patogeno fungino umano Candida albicans. Questa tecnica fornisce dati quantitativi sull'attività antifungina riducendo i tempi sperimentali e i rifiuti di plastica rispetto agli altri metodi che richiedono la creazione su agar.
Oltre a testare l'attività contro la Candida albicans, questo protocollo può essere utilizzato per testare l'attività contro altre cellule che formano lievito e per testare l'attività di agenti antifungini a piccole molecole Iniziare inoculando il ceppo desiderato di Candida albicans in 10 millilitri di estratto di lievito liquido-peptone-destrosio, o mezzo YPD, in una provetta di coltura. Coltiva la coltura durante la notte a 30 gradi Celsius e 230 giri / min su uno shaker rotante. Subcultura la coltura notturna di C.albicans e crescere fino a una densità ottica di circa 1,0 a 1,2 a 600 nanometri di lunghezza d'onda.
Solubilizzare ciascun peptide in acqua sterile e diluirlo al doppio della concentrazione massima desiderata, quindi aggiungere 40 microlitri delle soluzioni di calcio peptidico desiderate al primo pozzetto di ogni fila in una piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti. Quindi, aggiungere 20 microlitri di acqua ultrapura sterile alle colonne da 2 a 12 delle righe contenenti il peptide. Per diluire in serie le soluzioni di peptide sulla piastra fino alla colonna 10, trasferire 20 microlitri dalla colonna 1 alla colonna 2 e mescolarle mediante pipettaggio su e giù.
Ripetere il processo di diluizione fino alla colonna 10 che conterrà 40 microlitri di soluzione peptidica ad una diluizione da 1 a 512 della concentrazione della colonna 1. Una volta fatto, rimuovere 20 microlitri di soluzione peptidica dalla colonna 10 e scartarla. Trasferire la sottocoltura di C.albicans in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e centrifugare a 3.900 g per 3 minuti a temperatura ambiente.
Rimuovere il surnatante mediante pipettaggio o decantazione. Risospendere il pellet con 1 millilitro di tampone fosfato di sodio da 2 millimolari e trasferire la sospensione in una provetta da centrifuga da 1,7 millilitri. Pellettare le celle centrifugando e scartare il surnatante.
Ancora una volta, risospendere il pellet in 1 millilitro di tampone fosfato di sodio 2-millimolare e lavare altre 2 volte per lasciare le cellule lavate in 1 millilitro di tampone fosfato di sodio. Determinare la densità cellulare della sospensione cellulare lavata e diluire la sospensione a 5 volte 10 alla 5a cella per millilitro in un tampone fosfato di sodio 2 millimolare. Prendere la sospensione diluita di cellule di C.albicans e aggiungere 20 microlitri alle colonne da 1 a 10 e alla colonna 12 di ciascuna riga, quindi aggiungere 20 microlitri di tampone fosfato di sodio 2-millimolare alla colonna 11.
Coprire la piastra 1 e posizionarla in un'incubatrice a 30 gradi Celsius per 30 minuti. Preparare una nuova piastra di coltura a 96 pozzetti per quantificare la vitalità aggiungendo 100 microlitri di YPD a tutti i pozzetti della piastra numero 2, quindi aggiungere 100 microlitri di tampone fosfato di sodio 2-millimolare a tutti i pozzetti della piastra 2. Per diluire i campioni nella piastra 1, recuperare la piastra 1 dall'incubatore e aggiungere 280 microlitri di tampone fosfato di sodio 1-millimolare in ciascun pozzetto.
Dopo aver mescolato bene il contenuto con una pipetta, trasferire 8 microlitri dalla piastra 1 al pozzetto corrispondente della piastra 2. Una volta fatto, posizionare la piastra coperta 2 su uno scuotitore a micropiastre a 350 giri / min per 17 ore a 30 gradi Celsius. Mescolare tutti i pozzetti nella piastra 2 mediante pipettaggio su e giù, assicurandosi che tutte le celle siano risospese.
Ottenere letture di densità ottica a una lunghezza d'onda di 600 nanometri per ciascun pozzetto nella piastra 2 utilizzando un lettore di piastre di assorbanza. Tracciare la riduzione della vitalità in funzione della concentrazione del peptide per calcolare la percentuale di inibizione della crescita e determinare l'effetto dei peptidi sulla crescita di C.albicans. Dopo aver incubato i peptidi con le cellule di C.albicans, l'attività antifungina è stata quantificata utilizzando le unità formanti colonie, o metodo di conteggio CFU e il protocollo descritto che incorpora misure di densità ottica.
I dati che utilizzano le letture della densità ottica erano altamente riproducibili come indicato dalle piccole deviazioni standard delle repliche. Nell'eseguire questo protocollo, mantenere le cellule di Candida albicans nella forma di lievito incubando le cellule a 30 gradi Celsius poiché le misurazioni della densità ottica non sono affidabili nelle cellule ifali. L'efficienza di questo metodo ha permesso ai ricercatori di eseguire studi tripli sull'attività peptidica testando un numero maggiore di peptidi e concentrazioni di peptidi.
