Peptide werden als neuartige antimykotische Moleküle untersucht. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die antimykotische Wirksamkeit gegen den menschlichen Pilzerreger Candida albicans zu untersuchen. Diese Technik liefert quantitative Daten zur antimykotischen Aktivität und reduziert gleichzeitig die Versuchszeit und den Plastikmüll im Vergleich zu den anderen Methoden, die die Herstellung auf Agar erfordern.
Zusätzlich zum Testen der Aktivität gegen Candida albicans kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Aktivität gegen andere hefebildende Zellen zu testen und die Aktivität von niedermolekularen Antimykotika zu testen. Beginnen Sie mit der Inokulation des gewünschten Candida albicans-Stammes in 10 Milliliter flüssigen Hefeextrakt-Pepton-Dextrose oder YPD-Medium in einem Kulturröhrchen. Züchten Sie die Kultur über Nacht bei 30 Grad Celsius und 230 U/min auf einem Rotationsschüttler. Subkultivieren Sie die Nachtkultur von C.albicans und wachsen Sie auf eine optische Dichte von etwa 1,0 bis 1,2 bei 600 Nanometern Wellenlänge.
Lösen Sie jedes Peptid in sterilem Wasser und verdünnen Sie es auf das Doppelte der gewünschten höchsten Konzentration, dann geben Sie 40 Mikroliter der gewünschten Peptidstammlösungen in die erste Vertiefung jeder Reihe in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden. Als nächstes geben Sie 20 Mikroliter steriles Reinstwasser in die Spalten 2 bis 12 der Reihen, die das Peptid enthalten. Um die Peptidstammlösungen seriell über die Platte bis zu Spalte 10 zu verdünnen, übertragen Sie 20 Mikroliter von Säule 1 in Spalte 2 und mischen Sie sie durch Auf- und Abpipettieren.
Wiederholen Sie den Verdünnungsprozess bis zu Spalte 10, die 40 Mikroliter Peptidlösung bei einer Verdünnung der Konzentration von Spalte 1 zu 512 enthält. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie 20 Mikroliter Peptidlösung aus Spalte 10 und entsorgen Sie sie. Die C.albicans-Subkultur wird in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt und 3 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 3.900 g zentrifugiert.
Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren oder Dekantieren. Resuspendieren Sie das Pellet mit 1 Milliliter 2-millimolaren Natriumphosphatpuffer und überführen Sie die Suspension in ein 1,7-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren und verwerfen Sie den Überstand.
Resuspendieren Sie das Pellet erneut in 1 Milliliter 2-millimolaren Natriumphosphatpuffer und waschen Sie es weitere 2 Mal, um die gewaschenen Zellen in 1 Milliliter Natriumphosphatpuffer zu belassen. Bestimmen Sie die Zelldichte der gewaschenen Zellsuspension und verdünnen Sie die Suspension auf 5 mal 10 bis zu den 5. Zellen pro Milliliter in einem 2-millimolaren Natriumphosphatpuffer. Nehmen Sie eine verdünnte C.albicans-Zellsuspension und fügen Sie 20 Mikroliter zu den Spalten 1 bis 10 und Spalte 12 jeder Zeile hinzu, dann fügen Sie 20 Mikroliter 2-millimolaren Natriumphosphatpuffer zu Spalte 11 hinzu.
Decken Sie die Platte 1 ab und legen Sie sie für 30 Minuten in einen Inkubator bei 30 Grad Celsius. Bereiten Sie eine neue 96-Well-Kulturplatte vor, um die Lebensfähigkeit zu quantifizieren, indem Sie 100 Mikroliter YPD in alle Vertiefungen von Platte Nummer 2 geben und dann 100 Mikroliter 2-millimolaren Natriumphosphatpuffer in alle Vertiefungen von Platte 2 geben. Um die Proben in Platte 1 zu verdünnen, entnehmen Sie Platte 1 aus dem Inkubator und geben Sie 280 Mikroliter 1-millimolaren Natriumphosphatpuffer in jede Vertiefung.
Nachdem Sie den Inhalt gut mit einer Pipette gemischt haben, geben Sie 8 Mikroliter von Platte 1 in die entsprechende Vertiefung von Platte 2. Wenn Sie fertig sind, legen Sie die abgedeckte Platte 2 für 17 Stunden bei 30 Grad Celsius bei 350 U/min auf einen Mikrotiterplattenschüttler. Mischen Sie alle Vertiefungen in Platte 2, indem Sie auf und ab pipettieren, um sicherzustellen, dass alle Zellen resuspendiert sind.
Erhalten Sie optische Dichtemesswerte bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern für jede Vertiefung in Platte 2 mit einem Absorptionsplattenleser. Zeichnen Sie die Verringerung der Lebensfähigkeit als Funktion der Peptidkonzentration auf, um den Prozentsatz der Wachstumshemmung zu berechnen und die Wirkung der Peptide auf das Wachstum von C. albicans zu bestimmen. Nach der Inkubation der Peptide mit den C. albicans-Zellen wurde die antimykotische Aktivität unter Verwendung der koloniebildenden Einheiten oder der KBE-Zählmethode und des beschriebenen Protokolls unter Einbeziehung optischer Dichtemessungen quantifiziert.
Die Daten, die die optischen Dichtemessungen verwendeten, waren hochgradig reproduzierbar, wie die kleinen Standardabweichungen der Replikate zeigten. Halten Sie bei der Durchführung dieses Protokolls die Candida albicans-Zellen in Hefeform, indem Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius inkubieren, da optische Dichtemessungen in den Hyphenzellen nicht zuverlässig sind. Die Effizienz dieser Methode hat es den Forschern ermöglicht, hohe Dreifachstudien zur Peptidaktivität durchzuführen, indem sie eine größere Anzahl von Peptiden und Peptidkonzentrationen testeten.
