يسمح هذا البروتوكول بالعزل الفعال والقابل للتكرار للجريبات قبل الغارية في المرحلة المبكرة من مبيض بقري واحد ويخلق فرصا جديدة لدراسة تكوين جريبات المبيض في الأنواع غير الأبقارية. باستخدام عدد أكبر من البصيلات من مبيض واحد ، تتيح هذه التقنية العلاج في الجسم الحي قبل حصاد المبيض ، أو أخذ عينات متعددة بمرور الوقت من نفس الحيوان عن طريق خزعة المبيض. يمكن أن يكون عزل بصيلات ما قبل الغار في المرحلة المبكرة والحفاظ عليها بالتبريد خيارا قيما للحفاظ على الخصوبة لدى الشابات اللائي يخضعن للعلاج السام للغدد التناسلية مثل العلاج الكيميائي ، وكذلك الحفاظ على الأصول الوراثية من الأنواع المهددة بالانقراض.
سيوضح الإجراء ستيفاني ماكدونيل وأماندا مورتون وجوليانا كانديلاريا ، طلاب الدكتوراه من مختبري. للبدء ، انقل المبايض في المختبر إلى برنامج تلفزيوني دافئ ومعقم يحتوي على Pen-Strep واختر المبايض التي تحتوي على العديد من الجريبات الغارية الصغيرة ولا يوجد جسم لوتيتيوم بارز. قم بإزالة أي نسيج ضام زائد ودهون من المبيضين باستخدام المقص.
نقل المبيض واحد إلى لوح التقطيع على ورقة مقاعد البدلاء. باستخدام مشرط ، اقطع المبيض إلى نصفين طوليا من موقع ربط الرباط إلى موقع التعلق المقابل. احتفظ بنصف المبيض على لوح التقطيع لتتم معالجته وضع النصف الآخر من المبيض مرة أخرى في برنامج تلفزيوني دافئ يحتوي على Pen-Strep.
لإزالة النخاع ، قطعه على طول انحناء المبيض على بعد حوالي 2 ملليمتر من السطح دون قطع القشرة بحيث يكون النخاع المكشوف متجها لأعلى. قطعي الجرح لأسفل لإزالة غالبية النخاع. اقلب نصف المبيض بحيث تكون الظهارة متجهة لأعلى واستخدم المشرط لإنهاء قطع النخاع بعيدا عن القشرة وتقليم أي نسيج ضام أبيض متبق حول حافة قطعة المبيض المتصلة بالأربطة.
بمجرد إزالة غالبية النخاع ، استخدم المشرط لقطع القشرة إلى سمك 1 ملليمتر تقريبا أثناء التلاعب بالمشرط بحركات صغيرة ذهابا وإيابا لحلق ما تبقى من النخاع ، ثم قطع نصف قشرة المبيض إلى قطعتين. احتفظ بقطع القشرة في برنامج تلفزيوني دافئ يحتوي على Pen-Strep حتى تصبح جاهزة للتقطيع. انقل قطعة واحدة من القشرة إلى طبق بتري على مفرمة الأنسجة وبلل المنديل بثلاث أو أربع قطرات من برنامج تلفزيوني دافئ يحتوي على Pen-Strep.
أثناء تثبيت قطعة الأنسجة بزوج من الملقط ، اضغط على زر إعادة الضبط مرة واحدة لبدء تشغيل مفرمة المناديل. بعد قطع قطعة القشرة بالكامل إلى شرائح ، استخدم مقبض حامل الشفرة لرفع الشفرة عن طبق بتري والملقط لإزالة أي نسيج من الشفرة. بعد تدوير حامل اللوحة بمقدار 90 درجة ، مرة أخرى ، اضغط على زر إعادة الضبط ومرر الشفرة بالكامل عبر شرائط الأنسجة.
استخدم مقبض حامل الشفرة لرفع الشفرة عن طبق بتري والملقط لإزالة أي نسيج من الشفرة كما هو موضح سابقا. باستخدام ماصة نقل و PBS دافئ يحتوي على Pen-Strep ، اغسل الأنسجة المفرومة في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر تم تسخينه مسبقا. أعد الأنبوب المخروطي إلى الماء أو حمام الخرز للحفاظ على دفء الأنسجة المفرومة مع تكرار إجراء التقطيع مع النصفين الثلاثة الآخرين من المبيض.
للحصول على أفضل نتائج القطع ، استخدم مشغل الصواميل لإزالة الجوز من ذراع التقطيع وإزالة الغسالة وقفل الشفرة. باستخدام ملقط ، قم بإزالة الشفرة من ذراع التقطيع. اقلبها بحيث تكون الحافة غير المستخدمة مواجهة لطبق بتري وضعها مرة أخرى على ذراع التقطيع.
بعد التأكد من توصيل وحدة الخالط وضبط السرعة على الشريط الثاني ، أدخل مسبار المولد 10 ملم في الوحدة وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، اضبط مؤقتا لمدة 1 دقيقة وأدخل المسبار في الأنبوب المخروطي سعة 50 ملليلتر الذي يحتوي على أنسجة القشرة المفرومة من مبيض واحد وما يكفي من PBS الذي يحتوي على Pen-Strep لملء الأنبوب إلى خط 25 ملليلتر. يجب أن يكون العمق الذي يتم إدخال المسبار فيه 1/3 من ارتفاع السائل المقاس من أسفل الغرفة.
بمجرد بدء تشغيل المؤقت ، قم بتشغيل الخالط ، وتأكد من أن الجزء السفلي من المسبار لا يلمس الأنبوب وأمسك الأنبوب أثناء تشغيل الخالط. بعد 1 دقيقة من التجانس ، قم بإزالة المسبار من الأنبوب ، ثم قم بإزالة أي نسيج ضام يسد فتحات التهوية في الفراغ بين سكين الدوار وأنبوب الدوار أو قطع القشرة العالقة في المسبار باستخدام ملقط ووضعها مرة أخرى في الأنبوب. صب الأنسجة المشتتة في القمع المغطى بالقماش القطني ، وإدخالها في قارورة Erlenmeyer وشطف محتويات الأنبوب في القمع باستخدام PBS الدافئ.
أخيرا ، اشطف القماش القطني باستخدام برنامج تلفزيوني دافئ. أجبر السائل في شظايا صغيرة على المرور عبر ثقوب القماش عن طريق لف القماش القطني حول شظايا الأنسجة لأسفل والضغط حتى تتم إزالة جميع السوائل والأنسجة الزائدة من القماش القطني. بعد إعادة فتح القماش القطني فوق القمع ، اشطف القماش القطني باستخدام PBS الذي يحتوي على Pen-Strep باستخدام ماصة نقل ، ومرة أخرى ، اضغط على أي شظايا أنسجة متبقية من خلال القماش.
باستخدام مرقئ مائي، أمسك مصفاة الخلايا التي سقطرها 300 ميكرومتر فوق كأس زجاجية سعة 200 ملليلتر، واسكب الراشح في دورق إرلنماير عبر مصفاة الخلية. إذا أصبحت مصفاة الخلية مسدودة بالأنسجة ، فاضغط عليها برفق على الدورق ، ثم اقلب المصفاة رأسا على عقب واضغط على بقايا الأنسجة الكبيرة على ورق الطاولة. شطف محتويات القارورة باستخدام PBS الدافئة التي تحتوي على Pen-Strep حتى لا تبقى شظايا الأنسجة وصبها في مصفاة الخلية.
بعد ذلك، أثناء إمساك مصفاة الخلايا التي سقطرها 40 ميكرومترا بمرقئ فوق كأس زجاجية ثانية سعة 200 ملليلتر، اسكب كل الراشح الأولي الموجود في الكأس الزجاجية الأولى سعة 200 ملليلتر عبر المصفاة، ثم اشطف محتويات الكأس الزجاجية باستخدام برنامج تلفزيوني دافئ يحتوي على Pen-Strep حتى لا تبقى شظايا نسيجية واسكبها في مصفاة الخلية. بعد تركيب إبرة قياس 18 في المحقنة سعة 20 ملليلتر ، املأ المحقنة بوسط غسل الجريب. باستخدام مرقئ ، أمسك مصفاة الخلايا التي يبلغ قطرها 40 ميكرومتر رأسا على عقب فوق طبق بتري مربع واستخدم المحقنة لغسل محتويات مصفاة الخلية في الطبق.
انقل طبق بتري المربع إلى مجسم مع مرحلة دافئة مضبوطة على 38.5 درجة مئوية مع تكبير يتراوح بين 1.25 و 3.2x. بعد تحديد بصيلات من طبق بتري المربع ، انقل المسام لغسل قطرات متوسطة باستخدام الماصة الدقيقة. يظهر العدد الإجمالي للبصيلات المعزولة قبل الغار لكل تكرار باستخدام تجانس الأنسجة لمدة 6 دقائق متوسط 41 جريبة لكل تكرار ، تتراوح من 11 إلى 135 بصيلة.
أظهر تقييم المرحلة التنموية ل 476 جريبة معزولة أن الغالبية كانت في المرحلة الأولية من التطور ، حيث تم قياس 40 إلى 79 ميكرومتر في احتواء طبقة واحدة من الخلايا الحبيبية المكعبة. أسفر تجانس قشرة المبيض لمدة 6 دقائق عن عدد أكبر من بصيلات ما قبل الغار مقارنة ب 5 دقائق من التجانس بنفس السرعة. تم تقييم التعبير النصي لعلامة الخلية الحبيبية لمستقبلات FSH وعلامة الخلايا الجرثومية DAZL في البصيلات باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي مما يدل على أن كلا من البصيلات الأولية والثانوية المبكرة عبرت عن مستقبلات FSH ونصوص DAZL.
يظهر التوطين المناعي ل CX37 في بصيلات ما قبل الغار المعزولة في كل من المراحل الأولية والثانوية المبكرة أن CX37 كان موضعيا في بلازما O ، حيث كان غائبا عن نواة موقع O وإلى غشاء الخلايا الحبيبية. في تجربتنا ، يعد التشريح السليم لطبقة رقيقة من الأنسجة القشرية ، وتقطيع الأنسجة إلى الحجم الصحيح ، والتجانس المناسب خطوات حاسمة لضمان إطلاق بصيلات قابلة للحياة من الأنسجة. يمكن استخدام الجريبات المعزولة قبل الغارية للإجابة على أسئلة مثل تنظيم نمو الجريب قبل الغار وطبيعة التفاعلات بين الخلايا الحبيبية والبويضة ، وبالتالي تسهيل تطوير ظروف زراعة أكثر كفاءة.
