Isolamento de pequenos folículos pré-antrais do ovário bovino usando uma combinação de fragmentação, homogeneização e filtração seriada

Este protocolo permite o isolamento eficiente e repetível de folículos pré-antrais em estágio inicial de um único ovário bovino e cria novas oportunidades para o estudo da foliculogênese ovariana em uma espécie não bovina. Ao utilizar um maior número de folículos de um único ovário, esta técnica permite tratamentos in vivo antes da colheita do ovário, ou a obtenção de múltiplas amostras ao longo do tempo do mesmo animal através de biópsia ovariana. O isolamento e a criopreservação de folículos pré-antrais em estágio inicial podem ser uma opção valiosa para a preservação da fertilidade em mulheres jovens submetidas a tratamento gonadotóxico, como quimioterapia, bem como a preservação de germoplasma de espécies ameaçadas de extinção.

Demonstrando o procedimento estarão Stephanie McDonnell, Amanda Morton e Juliana Candelaria, estudantes de doutorado do meu laboratório. Para começar, transfira os ovários em laboratório para PBS quente e estéril contendo Pen-Strep e selecione ovários com muitos folículos antrais pequenos e sem corpo lutécio proeminente. Remova qualquer excesso de tecido conjuntivo e gordura dos ovários usando uma tesoura.

Transfira um ovário para a tábua de corte no papel de bancada. Usando um bisturi, corte o ovário ao meio longitudinalmente de um local de fixação ligamentar para o local de fixação oposto. Mantenha uma metade do ovário na tábua de corte a ser processada e coloque a outra metade do ovário de volta em PBS quente contendo Pen-Strep.

Para remover a medula, corte ao longo da curvatura do ovário a aproximadamente 2 milímetros de distância da superfície sem cortar o córtex com a medula exposta voltada para cima. Fatie o corte para remover a maior parte da medula. Vire o ovário pela metade para que o epitélio fique voltado para cima e use o bisturi para terminar de cortar a medula para longe do córtex e cortar qualquer tecido conjuntivo branco restante ao redor da borda da peça do ovário que foi conectada aos ligamentos.

Uma vez que a maioria da medula é removida, use o bisturi para cortar o córtex a aproximadamente 1 milímetro de espessura enquanto manipula o bisturi com pequenos movimentos de ida e volta para raspar o restante da medula e, em seguida, corte cada córtex do ovário metade em dois pedaços. Mantenha as peças do córtex em PBS quente contendo Pen-Strep até que estejam prontas para cortar. Transfira um único pedaço do córtex para a placa de Petri no helicóptero de tecido e molhe o tecido com três ou quatro gotas de PBS quente contendo Pen-Strep.

Enquanto mantém o pedaço de tecido firme com um par de pinças, pressione o botão Reset uma vez para iniciar o cortador de tecido. Depois que todo o pedaço do córtex tiver sido cortado em tiras, use o botão do suporte da lâmina para levantar a lâmina da placa de Petri e a pinça para remover qualquer tecido da lâmina. Depois de girar o suporte da placa em 90 graus, novamente, pressione o botão Reset e passe a lâmina inteiramente através das tiras de tecido.

Use o botão do suporte da lâmina para levantar a lâmina da placa de Petri e a pinça para remover qualquer tecido da lâmina, conforme demonstrado anteriormente. Usando uma pipeta de transferência e PBS quente contendo Pen-Strep, lave o tecido picado em um tubo cônico pré-aquecido de 50 mililitros. Devolva o tubo cônico ao banho de água ou grânulos para manter o tecido picado aquecido enquanto repete o procedimento de corte com as outras três metades do ovário.

Para obter melhores resultados de corte, use o driver de porca para remover a porca do braço de corte e remova a lavadora e o fecho da lâmina. Usando fórceps, remova a lâmina do braço de corte. Vire-o de modo que a borda não utilizada fique voltada para a placa de Petri e coloque-a de volta no braço de corte.

Depois de garantir que a unidade homogeneizadora esteja conectada e a velocidade seja ajustada para a segunda barra, insira a sonda geradora de 10 milímetros na unidade de acordo com as especificações do fabricante. Em seguida, defina um temporizador por 1 minuto e insira a sonda no tubo cônico de 50 mililitros contendo o tecido do córtex picado de um ovário e PBS suficiente contendo Pen-Strep para encher o tubo até a linha de 25 mililitros. A profundidade a que a sonda é inserida deve ser de 1/3 da altura do líquido, medida a partir do fundo da câmara.

Quando o temporizador for iniciado, ligue o homogeneizador, garantindo que o fundo da sonda não toque no tubo e mantenha o tubo imóvel enquanto o homogeneizador está ligado. Após 1 minuto de homogeneização, remova a sonda do tubo e, em seguida, remova qualquer tecido conjuntivo que obstrua os orifícios de ventilação no espaço entre a faca do rotor e o tubo do rotor ou as peças do córtex presas na sonda usando pinça e coloque-as de volta no tubo. Deitar o tecido disperso na ampola coberta de gaze, inserida no balão de Erlenmeyer e enxaguar o conteúdo do tubo na ampola utilizando PBS quente.

Finalmente, lave o pano de queijo com PBS morno. Força o líquido em pequenos fragmentos a passar pelos orifícios do pano, torcendo o pano de queijo em torno dos fragmentos de tecido para baixo e apertando até que todo o excesso de fluido e tecido seja removido do pano de queijo. Depois de reabrir o pano de queijo sobre o funil, lave o pano de queijo com PBS contendo Pen-Strep usando uma pipeta de transferência e, novamente, esprema quaisquer fragmentos de tecido residual através do pano.

Usando um hemostático, segure o filtro celular de 300 micrômetros sobre um copo de 200 mililitros e despeje o filtrado no frasco de Erlenmeyer através do filtro celular. Se o filtro celular ficar entupido com tecido, bata-o suavemente contra o copo, em seguida, vire o filtro de cabeça para baixo e toque os grandes detritos de tecido no papel de bancada. Enxaguar o conteúdo do balão utilizando PBS quente contendo Pen-Strep até que não restem fragmentos de tecido e deitá-lo no coador celular.

Em seguida, enquanto segura o filtro celular de 40 micrômetros com um hemostato sobre um segundo copo de 200 mililitros, despeje todo o filtrado inicial presente no primeiro copo de 200 mililitros através do filtro e, em seguida, lave o conteúdo do copo usando PBS quente contendo Pen-Strep até que nenhum fragmento de tecido permaneça e despeje-o no filtro celular. Depois de encaixar a agulha de calibre 18 na seringa de 20 mililitros, encha a seringa com o meio de lavagem do folículo. Com um hemostático, segure o filtro celular de 40 micrômetros de cabeça para baixo sobre uma placa de Petri quadrada e use a seringa para lavar o conteúdo do filtro celular no prato.

Transfira a placa de Petri quadrada para um estereoscópio com um estágio quente ajustado a 38,5 graus Celsius com uma ampliação definida entre 1,25 e 3,2x. Depois de identificar os folículos da placa de Petri quadrada, transfira o folículo para lavar gotas médias usando a micropipeta. O número total de folículos pré-antrais isolados por replicado utilizando homogeneização tecidual de 6 minutos mostra uma média de 41 folículos por replicado, variando de 11 a 135 folículos.

A avaliação do estágio de desenvolvimento de 476 folículos isolados mostrou que a maioria estava no estágio primário de desenvolvimento, medindo de 40 a 79 micrômetros contendo uma camada de células granulosas cuboidais. A homogeneização do córtex ovariano por 6 minutos produziu um maior número de folículos pré-antrais em comparação com 5 minutos de homogeneização na mesma velocidade. A expressão do transcrito do receptor FSH marcador de células granulosas e do marcador de células germinativas DAZL nos folículos foi avaliada usando PCR quantitativa de transcrição reversa, demonstrando que os folículos primários e secundários precoces expressavam o receptor de FSH e os transcritos de DAZL.

A localização imunofluorescente do CX37 em folículos pré-antrais isolados nos estágios primário e secundário inicial mostra que o CX37 estava localizado no plasma O, estando ausente do núcleo do sítio O e da membrana das células granulosas. Em nossa experiência, a dissecção adequada de uma fina camada de tecido cortical, o corte do tecido no tamanho certo e a homogeneização adequada são etapas críticas para garantir a liberação de folículos viáveis do tecido. Folículos pré-antrais isolados podem ser utilizados para responder a questões como a regulação do crescimento do folículo pré-antral e a natureza das interações entre as células granulosas e o ovócito, facilitando assim o desenvolvimento de condições de cultura mais eficientes.