Ce protocole permet l’isolement efficace et reproductible des follicules pré-antraux à un stade précoce d’un seul ovaire bovin et crée de nouvelles opportunités pour l’étude de la folliculogenèse ovarienne chez une espèce non bovine. En utilisant un plus grand nombre de follicules d’un seul ovaire, cette technique permet des traitements in vivo avant la récolte des ovaires, ou l’obtention de plusieurs échantillons au fil du temps à partir du même animal par biopsie ovarienne. L’isolement et la cryoconservation des follicules pré-antraux à un stade précoce peuvent être une option précieuse pour la préservation de la fertilité chez les jeunes femmes subissant un traitement gonadotoxique tel que la chimiothérapie, ainsi que la préservation du germoplasme d’espèces menacées.
Stephanie McDonnell, Amanda Morton et Juliana Candelaria, doctorantes de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, transférez les ovaires en laboratoire dans un PBS chaud et stérile contenant Pen-Strep et sélectionnez des ovaires avec de nombreux petits follicules antraux et aucun corps lutécium proéminent. Enlevez tout excès de tissu conjonctif et de graisse des ovaires à l’aide de ciseaux.
Transférer un ovaire sur la planche à découper sur le papier de paillasse. À l’aide d’un scalpel, couper l’ovaire en deux longitudinalement d’un site de fixation ligamentaire au site de fixation opposé. Gardez une moitié de l’ovaire sur la planche à découper à traiter et replacez l’autre moitié de l’ovaire dans du PBS chaud contenant Pen-Strep.
Pour enlever la moelle, tranchez le long de la courbure de l’ovaire à environ 2 millimètres de la surface sans couper à travers le cortex avec la moelle exposée tournée vers le haut. Trancher à travers la coupe pour enlever la majorité de la moelle. Retournez l’ovaire à moitié de sorte que l’épithélium soit tourné vers le haut et utilisez le scalpel pour finir de couper la moelle du cortex et couper tout tissu conjonctif blanc restant autour du bord de la pièce ovarienne qui était reliée aux ligaments.
Une fois que la majorité de la moelle est enlevée, utilisez le scalpel pour couper le cortex à environ 1 millimètre d’épaisseur tout en manipulant le scalpel avec de petits mouvements de va-et-vient pour raser le reste de la moelle, puis couper chaque cortex ovarien en deux morceaux. Gardez les morceaux de cortex dans du PBS chaud contenant Pen-Strep jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être hachés. Transférer un seul morceau du cortex dans la boîte de Petri sur le hachoir à tissus et mouiller le tissu avec trois ou quatre gouttes de PBS chaud contenant Pen-Strep.
Tout en maintenant le morceau de tissu stable avec une paire de pinces, appuyez une fois sur le bouton de réinitialisation pour démarrer le hacheur de tissu. Une fois que tout le morceau du cortex a été coupé en bandes, utilisez le bouton du porte-lame pour soulever la lame de la boîte de Petri et les pinces pour enlever tout tissu de la lame. Après avoir fait pivoter le support de plaque de 90 degrés, appuyez à nouveau sur le bouton de réinitialisation et passez entièrement la lame à travers les bandes de tissu.
Utilisez le bouton du porte-lame pour soulever la lame de la boîte de Petri et la pince pour enlever tout tissu de la lame, comme démontré précédemment. À l’aide d’une pipette de transfert et d’un PBS chaud contenant du Pen-Strep, laver le tissu haché dans un tube conique préchauffé de 50 millilitres. Remettez le tube conique dans l’eau ou le bain de perles pour garder le tissu haché au chaud tout en répétant la procédure de hachage avec les trois autres moitiés de l’ovaire.
Pour de meilleurs résultats de coupe, utilisez le pilote d’écrou pour retirer l’écrou du bras de découpe et retirez la rondelle et le fermoir de la lame. À l’aide d’une pince, retirez la lame du bras de coupe. Retournez de sorte que le bord inutilisé soit face à la boîte de Petri et replacez-le sur le bras de hachage.
Après vous être assuré que l’homogénéisateur est branché et que la vitesse est réglée sur la deuxième barre, insérez la sonde du générateur de 10 millimètres dans l’unité conformément aux spécifications du fabricant. Ensuite, réglez une minuterie pendant 1 minute et insérez la sonde dans le tube conique de 50 millilitres contenant le tissu cortex haché d’un ovaire et suffisamment de PBS contenant Pen-Strep pour remplir le tube à la ligne de 25 millilitres. La profondeur à laquelle la sonde est insérée doit être égale à 1/3 de la hauteur du liquide mesurée à partir du fond de la chambre.
Une fois la minuterie démarrée, allumez l’homogénéisateur, en veillant à ce que le bas de la sonde ne touche pas le tube et maintenez le tube immobile pendant que l’homogénéisateur est allumé. Après 1 minute d’homogénéisation, retirez la sonde du tube, puis retirez tout tissu conjonctif obstruant les trous de ventilation dans l’espace entre le couteau rotor et le tube du rotor ou les morceaux de cortex coincés dans la sonde à l’aide d’une pince et replacez-les dans le tube. Verser le tissu dispersé dans l’entonnoir recouvert d’étamine, inséré dans l’erlenmeyer et rincer le contenu du tube dans l’entonnoir à l’aide de PBS chaud.
Enfin, rincez l’étamine avec du PBS chaud. Forcez le liquide en petits fragments à passer à travers les trous du tissu en tordant l’étamine autour des fragments de tissu vers le bas et en pressant jusqu’à ce que tout excès de liquide et de tissu soit retiré de l’étamine. Après avoir rouvert l’étamine sur l’entonnoir, rincez l’étamine avec du PBS contenant Pen-Strep à l’aide d’une pipette de transfert et, encore une fois, pressez tous les fragments de tissu résiduels à travers le chiffon.
À l’aide d’un hémostatique, tenir la crépine cellulaire de 300 micromètres au-dessus d’un bécher de 200 millilitres et verser le filtrat dans l’erlenmeyer à travers la crépine cellulaire. Si la crépine cellulaire est obstruée par du tissu, tapotez-la doucement contre le bécher, puis retournez la passoire et tapotez les gros débris de tissu sur le papier de banc. Rincer le contenu de la fiole à l’aide de PBS chaud contenant du Pen-Strep jusqu’à ce qu’il ne reste plus aucun fragment de tissu et verser dans la passoire cellulaire.
Ensuite, tout en tenant la passoire cellulaire de 40 micromètres avec un hémostatique sur un deuxième bécher de 200 millilitres, versez tout le filtrat initial présent dans le premier bécher de 200 millilitres à travers la passoire, puis rincez le contenu du bécher à l’aide de PBS chaud contenant du Pen-Strep jusqu’à ce qu’il ne reste plus de fragments de tissu et versez-le dans la passoire cellulaire. Après avoir ajusté l’aiguille de calibre 18 à la seringue de 20 millilitres, remplissez la seringue avec du produit de lavage de follicule. Avec un hémostatique, tenez la passoire cellulaire de 40 micromètres à l’envers sur une boîte de Petri carrée et utilisez la seringue pour laver le contenu de la passoire cellulaire dans la boîte.
Transférer la boîte de Petri carrée dans un stéréoscope avec une scène chaude réglée à 38,5 degrés Celsius avec un grossissement réglé entre 1,25 et 3,2x. Après avoir identifié les follicules de la boîte de Petri carrée, transférer le follicule pour laver les gouttes de milieu à l’aide de la micropipette. Le nombre total de follicules pré-antraux isolés par répétition en utilisant l’homogénéisation tissulaire de 6 minutes montre une moyenne de 41 follicules par réplication, allant de 11 à 135 follicules.
L’évaluation du stade de développement de 476 follicules isolés a montré que la majorité d’entre eux étaient au stade primaire de développement, mesurant de 40 à 79 micromètres contenant une couche de cellules cuboïdes de granulosa. L’homogénéisation du cortex ovarien pendant 6 minutes a donné un plus grand nombre de follicules pré-antraux par rapport à 5 minutes d’homogénéisation à la même vitesse. L’expression du marqueur cellulaire de la granulosa FSH et du marqueur germinale DAZL dans les follicules a été évaluée à l’aide de la PCR quantitative de transcription inverse démontrant que les follicules primaires et secondaires précoces exprimaient le récepteur FSH et les transcrits DAZL.
La localisation immunofluorescente du CX37 dans des follicules pré-antraux isolés aux stades primaire et secondaire précoce montre que le CX37 était localisé dans le plasme O, étant absent du noyau du site O et de la membrane des cellules de la granulosa. D’après notre expérience, la dissection appropriée d’une fine couche de tissu cortical, le hachage du tissu à la bonne taille et l’homogénéisation appropriée sont des étapes essentielles pour assurer la libération de follicules viables du tissu. Les follicules pré-antraux isolés peuvent être utilisés pour répondre à des questions telles que la régulation de la croissance du follicule pré-antral et la nature des interactions entre les cellules de la granulosa et l’ovocyte, facilitant ainsi le développement de conditions de culture plus efficaces.
