このプロトコルは、単一のウシ卵巣からの初期段階の前胞状卵胞の効率的かつ再現性のある単離を可能にし、非ウシ種における卵巣卵胞形成の研究のための新しい機会を生み出します。この技術は、単一の卵巣からより多くの卵胞を使用することにより、卵巣摘出前のin vivo治療、または卵巣生検を介して同じ動物からの複数のサンプルの経時的な観察を可能にします。初期段階の前胞胞の単離と凍結保存は、化学療法などの性腺毒性治療を受けている若い女性の生殖能力温存や、絶滅危惧種からの生殖質保存のための貴重な選択肢となる可能性があります。

手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるステファニー・マクドネル、アマンダ・モートン、ジュリアナ・カンデラリアです。まず、実験室で卵巣をPen-Strepを含む温かい滅菌PBSに移し、多くの小さな胞状卵胞があり、目立った黄体がない卵巣を選択します。ハサミを使用して卵巣から余分な結合組織と脂肪を取り除きます。

1つの卵巣をベンチペーパーのまな板に移します。メスを使用して、卵巣を一方の靭帯付着部位から反対側の付着部位まで縦方向に半分に切断します。卵巣の半分をまな板に置いて処理し、残りの半分をペンストレプトを含む温かいPBSに戻します。

髄質を除去するには、露出した髄質を上に向けて皮質を切断せずに、表面から約2ミリメートル離れた卵巣の湾曲に沿ってスライスします。切り口を切り開いて髄質の大部分を取り除きます。上皮が上を向くように卵巣を半分裏返し、メスを使用して髄質を皮質から切断し、靭帯に接続された卵巣片の端の周りに残っている白い結合組織を切り取ります。

髄質の大部分が除去されたら、メスを使用して皮質を約1ミリメートルの厚さに切断し、メスを小さな前後の動きで操作して残りの髄質を削り取り、各卵巣皮質を半分に2つに切断します。切り刻む準備ができるまで、皮質片をペンストレプトを含む温かいPBSに保管してください。皮質の1つの部分をティッシュチョッパーのペトリ皿に移し、Pen-Strepを含む3〜4滴の温かいPBSで組織を濡らします。

鉗子で組織片をしっかりと保持しながら、リセットボタンを1回押してティッシュチョッパーを始動します。皮質全体がストリップに切断されたら、ブレードホルダーノブを使用してブレードをペトリ皿から持ち上げ、鉗子を使用してブレードから組織を取り除きます。プレートホルダーを90度回転させた後、もう一度リセットボタンを押して、ブレードをティッシュストリップに完全に通します。

ブレードホルダーノブを使用してブレードをペトリ皿から持ち上げ、鉗子を使用してブレードから組織を取り除きます。トランスファーピペットとPen-Strepを含む温かいPBSを使用して、刻んだ組織を事前に温めた50ミリリットルの円錐形のチューブに洗浄します。円錐形のチューブを水またはビーズバスに戻し、刻んだ組織を暖かく保ちながら、卵巣の他の3つの半分でチョッピング手順を繰り返します。

最良の切断結果を得るには、ナットドライバーを使用してチョッピングアームからナットを取り外し、ワッシャーとブレードクラスプを取り外します。鉗子を使用して、チョッピングアームからブレードを取り外します。未使用の端がペトリ皿に面するように裏返し、チョッピングアームに戻します。

ホモジナイザーユニットが接続され、速度が2番目のバーに設定されていることを確認したら、メーカーの仕様に従って10ミリメートルのジェネレータープローブをユニットに挿入します。次に、タイマーを1分に設定し、1つの卵巣から刻んだ皮質組織と、チューブを25ミリリットルのラインまで満たすのに十分なPBSを含むPen-Strepを含む50ミリリットルの円錐管にプローブを挿入します。プローブを挿入する深さは、チャンバーの底から測定した液体の高さの1/3である必要があります。

タイマーが開始したら、ホモジナイザーの電源を入れ、プローブの底がチューブに触れないようにし、ホモジナイザーがオンになっている間チューブを静止させます。1分間の均質化後、プローブをチューブから取り外し、ローターナイフとローターチューブの間のスペースにある通気孔を詰まらせている結合組織、または鉗子を使用してプローブに詰まった皮質片を取り除き、チューブに戻します。分散した組織をチーズクロスで覆われた漏斗に注ぎ、三角フラスコに挿入し、温かいPBSを使用してチューブの内容物を漏斗にすすぎます。

最後に、温かいPBSでチーズクロスを洗い流します。ティッシュフラグメントの周りにチーズクロスをひねり、余分な液体とティッシュがすべてチーズクロスから取り除かれるまで絞ることにより、小さな破片の液体を布の穴に通します。漏斗の上でチーズクロスを再度開いた後、トランスファーピペットを使用してPen-Strepを含むPBSでチーズクロスをすすぎ、再び布を通して残留組織片を絞ります。

止血材を使用して、300マイクロメートルのセルストレーナーを200ミリリットルのビーカーにかざし、セルストレーナーを通して三角フラスコにろ液を注ぎます。セルストレーナーがティッシュで詰まった場合は、ビーカーにそっと軽くたたいてから、ストレーナーを逆さまにして、大きな組織の破片をベンチペーパーにタップアウトします。組織片がなくなるまで、Pen-Strepを含む温かいPBSを使用してフラスコの内容物をすすぎ、細胞ストレーナーに注ぎます。

次に、止血剤付きの40マイクロメートルのセルストレーナーを2番目の200ミリリットルのビーカーにかざしながら、最初の200ミリリットルのビーカーに存在するすべての初期濾液をストレーナーに注ぎ、次に組織片がなくなるまでPen-Strepを含む温かいPBSを使用してビーカーの内容物をすすぎ、細胞ストレーナーに注ぎます。18ゲージの針を20ミリリットルのシリンジに取り付けた後、シリンジに卵胞洗浄媒体を充填します。止血剤を使用して、40マイクロメートルのセルストレーナーを正方形のペトリ皿の上に逆さまに持ち、シリンジを使用してセルストレーナーの内容物を皿に洗い流します。

正方形のペトリ皿を、ウォームステージを摂氏38.5度に設定し、倍率を1.25〜3.2倍に設定したステレオスコープに移します。正方形のペトリ皿から卵胞を同定した後、マイクロピペットを使用して卵胞を洗浄培地滴に移す。6分間の組織ホモジナイゼーションを使用した反復あたりの単離された前胞状卵胞の総数は、反復あたり平均41個の卵胞を示し、11〜135個の卵胞の範囲です。

476個の単離された卵胞の発生段階の評価は、大部分が発達の初期段階にあり、1層の立方体顆粒膜細胞を含む40〜79マイクロメートルであることを示しました。卵巣皮質の6分間の均質化は、同じ速度での5分間の均質化と比較して、より多くの前胞状卵胞をもたらした。卵胞における顆粒膜細胞マーカーFSH受容体および生殖細胞マーカーDAZLの転写産物発現を逆転写定量PCRを用いて評価し、一次卵胞および初期二次卵胞の両方がFSH受容体およびDAZL転写産物を発現したことを実証した。

単離された前胞状卵胞におけるCX37の免疫蛍光局在は、初代および初期二次段階の両方で、CX37がOプラズマに局在し、O部位の核および顆粒膜細胞の膜には存在しないことを示しています。私たちの経験では、皮質組織の薄層の適切な解剖、組織を適切なサイズに切り刻むこと、および適切な均質化は、組織からの生存可能な卵胞の放出を確実にするための重要なステップです。単離された前胞状卵胞は、前胞状卵胞の成長の調節や顆粒膜細胞と卵母細胞の間の相互作用の性質などの質問に答えるために使用でき、より効率的な培養条件の開発を促進します。