פרוטוקול זה מאפשר בידוד יעיל וניתן לחזרה של זקיקים קדם-אנטרליים בשלב מוקדם משחלת בקר בודדת והוא יוצר הזדמנויות חדשות לחקר זקיקים שחלתיים במין שאינו שור. על ידי שימוש במספר גדול יותר של זקיקים משחלה אחת, טכניקה זו מאפשרת טיפולי in vivo לפני קציר השחלה, או הסתרה של דגימות מרובות לאורך זמן מאותה חיה באמצעות ביופסיה שחלתית. בידוד ושימור קריו של זקיקים טרום-אנטרליים בשלב מוקדם יכולים להיות אופציה רבת ערך לשימור פוריות אצל נשים צעירות העוברות טיפולים גונדוטוקסיים כגון כימותרפיה, כמו גם שימור נבטים ממינים בסכנת הכחדה.
מי שידגימו את ההליך יהיו סטפני מקדונל, אמנדה מורטון וג'וליאנה קנדלריה, דוקטורנטיות מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להעביר את השחלות במעבדה ל- PBS חם וסטרילי המכיל Pen-Strep ושחלות נבחרות עם זקיקים אנטרליים קטנים רבים וללא קורפוס לוטטיום בולט. הסר כל רקמת חיבור עודפת ושומן מן השחלות באמצעות מספריים.
מעבירים שחלה אחת לקרש החיתוך על נייר הספסל. בעזרת אזמל חותכים את השחלה לחצי אורך מאתר חיבור של רצועה אחת לאתר החיבור הנגדי. יש לשמור מחצית אחת של השחלה על קרש החיתוך לעיבוד ולהחזיר את החצי השני של השחלה ל-PBS חם המכיל Pen-Strep.
כדי להסיר את medulla, פרוס לאורך העקמומיות של השחלה במרחק של כ -2 מילימטר מפני השטח מבלי לחתוך דרך קליפת המוח עם medulla חשוף פונה כלפי מעלה. פורסים את החתך כדי להסיר את רוב המדולה. הפוך את השחלה כך שהאפיתל פונה כלפי מעלה והשתמש באזמל כדי לסיים לחתוך את המדולה הרחק מקליפת המוח ולחתוך את כל רקמת החיבור הלבנה שנותרה סביב קצה השחלה שהייתה מחוברת לרצועות.
לאחר הסרת רוב המדולה, השתמשו באזמל כדי לחתוך את קליפת המוח לעובי של כמילימטר אחד תוך כדי מניפולציה של האזמל בתנועות קטנות קדימה ואחורה כדי לגלח את שארית המדולה, ואז חתכו כל חצי קליפת שחלה לשני חלקים. שמור את חתיכות קליפת המוח ב PBS חם המכיל Pen-Strep עד מוכן לקצוץ. מעבירים חתיכה אחת של קליפת המוח לצלחת פטרי על מסוק הרקמה ומרטיבים את הרקמה בשלוש או ארבע טיפות של PBS חם המכיל Pen-Strep.
תוך כדי החזקת פיסת הרקמה יציבה עם זוג מלקחיים, לחץ על כפתור האיפוס פעם אחת כדי להפעיל את מסוק הרקמה. לאחר שכל פיסת קליפת המוח נחתכה לרצועות, השתמש בידית מחזיק הלהב כדי להרים את הלהב מצלחת הפטרי ובמלקחיים כדי להסיר כל רקמה מהלהב. לאחר סיבוב מחזיק הצלחת ב -90 מעלות, שוב, לחץ על כפתור האיפוס והעבר את הלהב כולו דרך רצועות הרקמה.
השתמש בידית מחזיק הלהב כדי להרים את הלהב מעל צלחת פטרי ואת המלקחיים כדי להסיר כל רקמה מהלהב כפי שהוכח קודם לכן. באמצעות פיפטה העברה ו- PBS חם המכיל Pen-Strep, לשטוף את הרקמה הקצוצה לתוך צינור חרוטי מחמם מראש 50 מיליליטר. החזירו את הצינור החרוטי למים או לאמבטיית החרוזים כדי לשמור על הרקמה הקצוצה חמה תוך חזרה על הליך החיתוך עם שלושת החצאים האחרים של השחלה.
לקבלת תוצאות החיתוך הטובות ביותר, השתמש בדרייבר האום כדי להסיר את האגוז מזרוע החיתוך ולהסיר את מכונת הכביסה ואת אבזם הלהב. באמצעות מלקחיים, הסר את הלהב מזרוע החיתוך. הפוך אותו כך שהקצה שאינו בשימוש פונה לצלחת הפטרי והנח אותו בחזרה על זרוע החיתוך.
לאחר שווידאת שיחידת ההומוגנייזר מחוברת לחשמל והמהירות מוגדרת למוט השני, הכנס את בדיקת הגנרטור 10 מ"מ ליחידה בהתאם למפרט היצרן. לאחר מכן, הגדר טיימר למשך דקה אחת והכנס את הבדיקה לצינור החרוטי של 50 מיליליטר המכיל את רקמת קליפת המוח הקצוצה משחלה אחת ומספיק PBS המכיל Pen-Strep כדי למלא את הצינור לקו 25 מיליליטר. העומק שאליו מוכנסת הבדיקה חייב להיות 1/3 מגובה הנוזל הנמדד מתחתית התא.
ברגע שהטיימר מתחיל, הפעל את ההומוגנייזר, וודא שתחתית הבדיקה לא תיגע בצינור ותחזיק את הצינור עדיין בזמן שההומוגנייזר מופעל. לאחר דקה אחת של הומוגניזציה, הסר את הבדיקה מהצינור, ולאחר מכן הסר כל רקמת חיבור שסותמת את חורי האוורור ברווח שבין סכין הרוטור לצינור הרוטור או חלקי קליפת המוח שנתקעו בגשושית באמצעות מלקחיים והנח אותם בחזרה לתוך הצינור. יוצקים את הרקמה המפוזרת לתוך המשפך המכוסה בבד גבינה, מוכנס לתוך בקבוק Erlenmeyer ולשטוף את תוכן הצינור לתוך המשפך באמצעות PBS חם.
לבסוף, לשטוף את הגבינה עם PBS חם. מאלצים את הנוזל בשברים קטנים לעבור דרך חורי הבד על ידי סיבוב בד הגבינה סביב שברי הרקמה כלפי מטה וסחיטה עד שכל עודפי הנוזלים והרקמות מוסרים מבד הגבינה. לאחר פתיחה מחדש של מטלית הגבינה מעל המשפך, יש לשטוף את מטלית הגבינה עם PBS המכיל Pen-Strep באמצעות פיפטה העברה, ושוב, לסחוט את כל שאריות הרקמה דרך הבד.
בעזרת המוסטאט, החזיקו את מסננת התאים בקוטר 300 מיקרומטר מעל בקוטר 200 מיליליטר ושפכו את התסנין בבקבוק ארלנמאייר דרך מסננת התא. אם מסננת התאים נסתמת בטישו, טפחו אותה בעדינות על הכוס, ואז הפכו את המסננת וטפחו את פסולת הרקמה הגדולה על נייר הספסל. יש לשטוף את תכולת הבקבוקון באמצעות PBS חם המכיל Pen-Strep עד שלא יישארו שברי רקמה ולשפוך אותו לתוך מסננת התא.
לאחר מכן, תוך כדי החזקת מסננת התאים בגודל 40 מיקרומטר עם המוסטאט על שנייה של 200 מיליליטר, יוצקים את כל התסנין הראשוני שנמצא בכוס הראשונה של 200 מיליליטר דרך המסננת, ואז שוטפים את תוכן הכוס באמצעות PBS חם המכיל Pen-Strep עד שלא יישארו שברי רקמה ויוצקים אותו לתוך מסננת התא. לאחר התאמת מחט 18 מד למזרק 20 מיליליטר, למלא את המזרק עם מדיום שטיפת זקיקים. בעזרת המוסטאט, החזיקו את מסננת התאים בקוטר 40 מיקרומטר במהופך מעל צלחת פטרי מרובעת והשתמשו במזרק כדי לשטוף את תכולת מסננת התאים לתוך המנה.
מעבירים את צלחת הפטרי המרובעת לסטריאוסקופ עם סט במה חם ל-38.5 מעלות צלזיוס עם סט הגדלה בין 1.25 ל-3.2x. לאחר זיהוי הזקיקים מצלחת הפטרי המרובעת, מעבירים את הזקיק לשטיפת טיפות בינוניות באמצעות המיקרופיפטה. המספר הכולל של זקיקים קדם-אנטרליים מבודדים לכל שכפול באמצעות הומוגניזציה של רקמות של 6 דקות מראה ממוצע של 41 זקיקים לכל שכפול, הנעים בין 11 ל -135 זקיקים.
הערכת השלב ההתפתחותי של 476 זקיקים מבודדים הראתה כי רובם נמצאים בשלב הראשוני של ההתפתחות, בגודל 40 עד 79 מיקרומטר המכילים שכבה אחת של תאי גרנולוזה קובואידיים. הומוגניזציה של קליפת השחלות במשך 6 דקות הניבה מספר גדול יותר של זקיקים פרה-אנטרליים בהשוואה ל-5 דקות של הומוגניזציה באותה מהירות. ביטוי תעתיק של קולטן תא גרנולוזה קולטן FSH וסמן תא נבט DAZL בזקיקים הוערך באמצעות שעתוק לאחור כמותי PCR המדגים כי הן הזקיקים הראשוניים והן הזקיקים המשניים המוקדמים ביטאו את קולטן FSH ותעתיקי DAZL.
לוקליזציה אימונופלואורסצנטית של CX37 בזקיקים פרה-אנטרליים מבודדים הן בשלב הראשוני והן בשלב המשני המוקדם מראה כי CX37 היה מקומי לפלסמה O, בהיותו נעדר מהגרעין של אתר O ולקרום של תאי הגרנולוסה. מניסיוננו, דיסקציה נכונה של שכבה דקה של רקמת קליפת המוח, חיתוך הרקמה לגודל הנכון והומוגניות נכונה הם צעדים קריטיים כדי להבטיח שחרור של זקיקים בני קיימא מהרקמה. ניתן להשתמש בזקיקים קדם-אנטרליים מבודדים כדי לענות על שאלות כגון ויסות גדילת הזקיקים הקדם-אנטרליים ואופי האינטראקציות בין תאי גרנולוזה לביצית, ובכך להקל על התפתחותם של תנאי תרבית יעילים יותר.
