Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente und wiederholbare Isolierung präantraler Follikel im Frühstadium von einem einzigen Rindereierstock und schafft neue Möglichkeiten für die Untersuchung der Follikulogenese der Eierstöcke bei einer nicht-rindernen Spezies. Durch die Verwendung einer größeren Anzahl von Follikeln aus einem einzigen Eierstock ermöglicht diese Technik In-vivo-Behandlungen vor der Ernte der Eierstöcke oder die Verlagerung mehrerer Proben desselben Tieres im Laufe der Zeit durch eine Eierstockbiopsie. Die Isolierung und Kryokonservierung von präantralen Follikeln im Frühstadium kann eine wertvolle Option für die Erhaltung der Fruchtbarkeit bei jungen Frauen sein, die sich einer gonadotoxischen Behandlung wie Chemotherapie sowie der Keimplasmakonservierung von gefährdeten Arten unterziehen.
Stephanie McDonnell, Amanda Morton und Juliana Candelaria, Doktorandinnen aus meinem Labor, demonstrieren das Verfahren. Um zu beginnen, übertragen Sie Eierstöcke im Labor in warme, sterile PBS-haltige Pen-Streptokokken und ausgewählte Eierstöcke mit vielen kleinen Antralfollikeln und ohne prominentes Corpus lutetium. Entfernen Sie überschüssiges Bindegewebe und Fett aus den Eierstöcken mit einer Schere.
Übertragen Sie einen Eierstock auf das Schneidebrett auf dem Bankpapier. Schneiden Sie den Eierstock mit einem Skalpell längs von einer Bandbefestigungsstelle zur gegenüberliegenden Befestigungsstelle in zwei Hälften. Halten Sie eine Hälfte des Eierstocks auf dem zu bearbeitenden Schneidebrett und legen Sie die andere Hälfte des Eierstocks wieder in warmes PBS, das Pen-Streptokokken enthält.
Um die Medulla zu entfernen, schneiden Sie entlang der Krümmung des Eierstocks etwa 2 Millimeter von der Oberfläche entfernt, ohne den Kortex mit der freiliegenden Medulla nach oben zu schneiden. Durch den Schnitt schneiden, um den Großteil der Medulla zu entfernen. Drehen Sie den Eierstock zur Hälfte um, so dass das Epithel nach oben zeigt, und verwenden Sie das Skalpell, um das Schneiden der Medulla vom Kortex weg zu beenden und das verbleibende weiße Bindegewebe um den Rand des Eierstockstücks, das mit den Bändern verbunden war, wegzuschneiden.
Sobald der Großteil der Medulla entfernt ist, schneiden Sie den Kortex mit dem Skalpell auf etwa 1 Millimeter Dicke, während Sie das Skalpell mit kleinen Hin- und Herbewegungen manipulieren, um den Rest der Medulla wegzurasieren, und schneiden Sie dann jeden Eierstockkortex in zwei Stücke. Halten Sie die Kortexstücke in warmem PBS, das Pen-Streptokokken enthält, bis sie zum Hacken bereit sind. Übertragen Sie ein einzelnes Stück des Kortex auf die Petrischale auf dem Gewebehacker und befeuchten Sie das Gewebe mit drei oder vier Tropfen warmem PBS, das Pen-Streptokokken enthält.
Während Sie das Stück Gewebe mit einer Pinzette ruhig halten, drücken Sie einmal die Reset-Taste, um den Tissue-Häcksler zu starten. Nachdem das gesamte Stück des Kortex in Streifen geschnitten wurde, heben Sie die Klinge mit dem Klingenhalterknopf von der Petrischale und mit der Pinzette Gewebe von der Klinge ab. Nachdem Sie den Plattenhalter um 90 Grad gedreht haben, drücken Sie erneut die Reset-Taste und führen Sie die Klinge vollständig durch die Gewebestreifen.
Verwenden Sie den Klingenhalterknopf, um die Klinge von der Petrischale abzuheben, und die Pinzette, um jegliches Gewebe von der Klinge zu entfernen, wie zuvor gezeigt. Waschen Sie das gehackte Gewebe mit einer Transferpipette und warmem PBS, das Pen-Streptokokken enthält, in ein vorgewärmtes 50-Milliliter-konisches Röhrchen. Bringen Sie den konischen Schlauch in das Wasser- oder Perlenbad zurück, um das gehackte Gewebe warm zu halten, während Sie den Hackvorgang mit den anderen drei Hälften des Eierstocks wiederholen.
Für beste Schneidergebnisse verwenden Sie den Mutterntreiber, um die Mutter vom Schneidarm zu entfernen und die Unterlegscheibe und den Messerverschluss zu entfernen. Entfernen Sie die Klinge mit einer Pinzette vom Hackarm. Drehen Sie es um, so dass der unbenutzte Rand der Petrischale zugewandt ist, und legen Sie es wieder auf den Hackarm.
Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Homogenisatoreinheit eingesteckt und die Drehzahl auf den zweiten Balken eingestellt ist, setzen Sie die 10-Millimeter-Generatorsonde gemäß den Herstellerangaben in das Gerät ein. Als nächstes stellen Sie einen Timer auf 1 Minute und führen Sie die Sonde in das 50-Milliliter-konische Röhrchen ein, das das gehackte Kortexgewebe eines Eierstocks und genügend PBS mit Pen-Streptokokken enthält, um das Röhrchen bis zur 25-Milliliter-Linie zu füllen. Die Tiefe, in die die Sonde eingeführt wird, muss 1/3 der Höhe der Flüssigkeit betragen, die vom Boden der Kammer aus gemessen wird.
Sobald der Timer startet, schalten Sie den Homogenisator ein, stellen Sie sicher, dass der Boden der Sonde das Röhrchen nicht berührt, und halten Sie das Röhrchen still, während der Homogenisator eingeschaltet ist. Entfernen Sie nach 1 Minute Homogenisierung die Sonde aus dem Röhrchen, entfernen Sie dann das Bindegewebe, das die Entlüftungslöcher im Raum zwischen Rotormesser und Rotorrohr oder Kortexstücken, die in der Sonde stecken, mit einer Pinzette verstopfen, und legen Sie sie wieder in das Röhrchen ein. Gießen Sie das dispergierte Gewebe in den mit Käsetuch bedeckten Trichter, geben Sie ihn in den Erlenmeyerkolben und spülen Sie den Inhalt des Röhrchens mit warmem PBS in den Trichter.
Zum Schluss spülen Sie das Käsetuch mit warmem PBS ab. Zwingen Sie die Flüssigkeit in kleinen Fragmenten, durch die Löcher des Tuchs zu gelangen, indem Sie das Käsetuch um die Gewebefragmente drehen und zusammendrücken, bis alle überschüssige Flüssigkeit und Gewebe aus dem Käsetuch entfernt sind. Nachdem Sie das Käsetuch über dem Trichter wieder geöffnet haben, spülen Sie das Käsetuch mit PBS, das Pen-Streptokokken enthält, mit einer Transferpipette ab und drücken Sie erneut alle verbleibenden Gewebefragmente durch das Tuch.
Halten Sie das 300-Mikrometer-Zellsieb mit einem Hämostaten über ein 200-Milliliter-Becherglas und gießen Sie das Filtrat in den Erlenmeyerkolben durch das Zellsieb. Wenn das Zellsieb mit Gewebe verstopft ist, klopfen Sie es vorsichtig gegen das Becherglas, drehen Sie dann das Sieb auf den Kopf und klopfen Sie die großen Gewebereste auf das Bankpapier. Spülen Sie den Inhalt des Kolbens mit warmem PBS, das Pen-Streptokokken enthält, bis keine Gewebefragmente mehr vorhanden sind, und gießen Sie ihn in das Zellsieb.
Als nächstes gießen Sieb, während Sie das 40-Mikrometer-Zellsieb mit einem Hämostat über ein zweites 200-Milliliter-Becherglas halten, das gesamte im ersten 200-Milliliter-Becherglas vorhandene Ausgangsfiltrat durch das Sieb, spülen Sie dann den Inhalt des Becherglases mit warmem PBS, das Pen-Strep enthält, bis keine Gewebefragmente mehr übrig sind, und gießen Sie es in das Zellsieb. Nachdem Sie die 18-Gauge-Nadel an die 20-Milliliter-Spritze angepasst haben, füllen Sie die Spritze mit Follikelwaschmedium. Halten Sie mit einem Hämostat das 40-Mikrometer-Zellsieb kopfüber über eine quadratische Petrischale und waschen Sie mit der Spritze den Inhalt des Zellsiebs in die Schale aus.
Übertragen Sie die quadratische Petrischale auf ein Stereoskop mit einer auf 38,5 Grad Celsius eingestellten warmen Bühne mit einer Vergrößerung zwischen 1,25 und 3,2x. Nachdem Sie Follikel aus der quadratischen Petrischale identifiziert haben, übertragen Sie den Follikel, um mittlere Tropfen mit der Mikropipette zu waschen. Die Gesamtzahl der isolierten präantralen Follikel pro Replikat unter Verwendung der 6-minütigen Gewebehomogenisierung zeigt durchschnittlich 41 Follikel pro Replikat, die zwischen 11 und 135 Follikeln liegen.
Die Beurteilung des Entwicklungsstadiums von 476 isolierten Follikeln zeigte, dass sich die Mehrheit im primären Entwicklungsstadium befand und 40 bis 79 Mikrometer maß, um eine Schicht quaderförmiger Granulosazellen zu enthalten. Die Homogenisierung des Ovarialkortex für 6 Minuten ergab eine größere Anzahl präantraler Follikel im Vergleich zu 5 Minuten Homogenisierung bei gleicher Geschwindigkeit. Die Transkriptexpression des Granulosa-Zellmarkers FSH-Rezeptors und des Keimzellmarkers DAZL in den Follikeln wurde mittels quantitativer PCR der reversen Transkription ausgewertet, was zeigt, dass sowohl primäre als auch frühe sekundäre Follikel FSH-Rezeptor- und DAZL-Transkripte exprimierten.
Die Immunfluoreszenzlokalisation von CX37 in isolierten präantralen Follikeln sowohl im primären als auch im frühen sekundären Stadium zeigt, dass CX37 im O-Plasma lokalisiert war und im Kern der O-Stelle und in der Membran der Granulosazellen fehlte. Nach unserer Erfahrung sind die richtige Dissektion einer dünnen Schicht kortikalen Gewebes, das Zerkleinern des Gewebes auf die richtige Größe und die richtige Homogenisierung kritische Schritte, um die Freisetzung lebensfähiger Follikel aus dem Gewebe sicherzustellen. Isolierte präantrale Follikel können verwendet werden, um Fragen wie die Regulation des präantralen Follikelwachstums und die Art der Interaktionen zwischen Granulosazellen und der Eizelle zu beantworten und so die Entwicklung effizienterer Kulturbedingungen zu erleichtern.
