Этот протокол позволяет эффективно и повторяемо выделять преантральные фолликулы на ранней стадии из одного бычьего яичника и создает новые возможности для изучения фолликулогенеза яичников у небычьих видов. Используя большее количество фолликулов из одного яичника, этот метод позволяет проводить лечение in vivo до сбора яичников или получение нескольких образцов с течением времени от одного и того же животного с помощью биопсии яичников. Выделение и криосохранение преантральных фолликулов на ранней стадии может быть ценным вариантом для сохранения фертильности у молодых женщин, проходящих гонадотоксическое лечение, такое как химиотерапия, а также сохранение зародышевой плазмы от исчезающих видов.
Демонстрировать процедуру будут Стефани Макдоннелл, Аманда Мортон и Джулиана Канделария, аспиранты из моей лаборатории. Для начала переведите яичники в лаборатории на теплый, стерильный PBS, содержащий Pen-Strep, и выберите яичники со многими небольшими антральными фолликулами и без заметного желтого тела. Удалите излишки соединительной ткани и жира из яичников с помощью ножниц.
Переложите один яичник на разделочную доску на скамейке бумаги. С помощью скальпеля разрезайте завязь пополам продольно от одного места прикрепления связок к противоположному месту прикрепления. Держите одну половину яичника на разделочной доске для обработки, а другую половину яичника поместите обратно в теплый PBS, содержащий Pen-Strep.
Чтобы удалить продолговатый мозг, нарежьте вдоль кривизны яичника примерно на расстоянии 2 миллиметров от поверхности, не разрезая кору открытым продолговатым мозгом, обращенным вверх. Нарежьте разрез, чтобы удалить большую часть продолговатого мозга. Переверните завязь наполовину так, чтобы эпителий был обращен вверх, и используйте скальпель, чтобы закончить отрезать продолговатый мозг от коры и обрезать любую оставшуюся белую соединительную ткань вокруг края яичника, который был соединен со связками.
После того, как большая часть мозгового вещества удалена, используйте скальпель, чтобы разрезать кору примерно до 1-миллиметровой толщины, манипулируя скальпелем небольшими движениями вперед-назад, чтобы сбрить оставшуюся часть продолговатого мозга, а затем разрезать каждую кору яичников наполовину на две части. Держите кусочки коры в теплом PBS, содержащем Pen-Strep, пока они не будут готовы к измельчению. Переложите один кусочек коры в чашку Петри на измельчителе тканей и смочите ткань тремя или четырьмя каплями теплого PBS, содержащего Pen-Strep.
Удерживая кусок ткани устойчивым с помощью пары щипцов, нажмите кнопку Reset один раз, чтобы запустить измельчитель ткани. После того, как весь кусок коры будет разрезан на полоски, используйте ручку держателя лезвия, чтобы поднять лезвие с чашки Петри, и щипцы, чтобы удалить любую ткань из лезвия. После поворота держателя пластины на 90 градусов, снова нажмите кнопку Reset и проведите лезвие полностью через тканевые полоски.
Используйте ручку держателя лезвия, чтобы поднять лезвие с чашки Петри, и щипцы, чтобы удалить любую ткань из лезвия, как показано ранее. Используя переносную пипетку и теплый PBS, содержащий Pen-Strep, промойте измельченную ткань в предварительно нагретую 50-миллилитровую коническую трубку. Верните коническую трубку в ванну с водой или бисером, чтобы сохранить измельченную ткань теплой, повторяя процедуру измельчения с другими тремя половинами завязи.
Для достижения наилучших результатов резки используйте драйвер гайки, чтобы снять гайку с измельчающего рычага и снять шайбу и застежку лезвия. Используя щипцы, снимите лезвие с рубящей руки. Переверните его так, чтобы неиспользуемый край был обращен к чашке Петри, и поместите его обратно на рубящую руку.
Убедившись, что блок гомогенизатора подключен и скорость установлена на вторую планку, вставьте 10-миллиметровый датчик генератора в устройство в соответствии со спецификациями производителя. Затем установите таймер на 1 минуту и вставьте зонд в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую измельченную ткань коры из одного яичника и достаточное количество PBS, содержащего Pen-Strep, чтобы заполнить трубку до 25-миллилитровой линии. Глубина, на которую вставляется зонд, должна составлять 1/3 высоты жидкости, измеренной от нижней части камеры.
Как только таймер запустится, включите гомогенизатор, следя за тем, чтобы нижняя часть зонда не касалась трубки, и держите трубку неподвижно, пока гомогенизатор включен. После 1 минуты гомогенизации извлеките зонд из трубки, затем удалите любую соединительную ткань, засоряющую вентиляционные отверстия в пространстве между ножом ротора и трубкой ротора или кусками коры, застрявшими в зонде, используя щипцы, и поместите их обратно в трубку. Налейте дисперсную ткань в воронку, покрытую марлей, вставьте в колбу Эрленмейера и промойте содержимое трубки в воронку с помощью теплого PBS.
Наконец, промойте марлю теплым PBS. Заставьте жидкость небольшими фрагментами пройти через отверстия ткани, скручив марлю вокруг фрагментов ткани вниз и сжимая до тех пор, пока из марли не будут удалены вся лишняя жидкость и ткань. После повторного открытия марли над воронкой промойте марлю PBS, содержащей Pen-Strep, с помощью переносной пипетки, и снова сожмите любые остаточные фрагменты ткани через ткань.
Используя гемостат, проведите 300-микрометровый клеточный сетчатый фильтр над 200-миллилитровым стаканом и вылейте фильтрат в колбу Эрленмейера через клеточный ситечко. Если клеточное ситечко засоряется тканью, аккуратно прижмите его к стакану, затем переверните ситечко вверх дном и вытащите крупные обломки тканей на бумагу скамейки. Смойте содержимое колбы с помощью теплого PBS, содержащего Pen-Strep, пока не останется фрагментов ткани, и вылейте его в клеточный ситечко.
Затем, удерживая 40-микрометровый клеточный ситечко с гемостатом над вторым 200-миллилитровым стаканом, вылейте весь исходный фильтрат, присутствующий в первом 200-миллилитровом стакане, через ситечко, затем промойте содержимое стакана с использованием теплого PBS, содержащего Pen-Strep, пока не останется фрагментов ткани, и вылейте его в клеточный ситечко. После подгонки иглы 18 калибра к 20-миллилитровому шприцу заполните шприц средой для промывки фолликулов. С помощью гемостата держите 40-микрометровое клеточное ситечко вверх ногами над квадратной чашкой Петри и используйте шприц, чтобы вымыть содержимое клеточного ситечка в чашку.
Перенесите квадратную чашку Петри в стереоскоп с теплой сценой, установленной до 38,5 градусов Цельсия с увеличением от 1,25 до 3,2x. После выявления фолликулов из квадратной чашки Петри переведите фолликул на промывку средней каплей с помощью микропипетки. Общее количество изолированных преантральных фолликулов на репликат с использованием 6-минутной гомогенизации тканей показывает в среднем 41 фолликул на реплику, в диапазоне от 11 до 135 фолликулов.
Оценка стадии развития 476 изолированных фолликулов показала, что большинство из них находились в первичной стадии развития, измеряя от 40 до 79 микрометров в содержании одного слоя кубоидальных гранулезных клеток. Гомогенизация коры яичников в течение 6 минут давала большее количество преантральных фолликулов по сравнению с 5 минутами гомогенизации с той же скоростью. Экспрессия транскрипта рецептора ФСГ-клеточного маркера гранулезы и маркера зародышевых клеток DAZL в фолликулах оценивали с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией, демонстрирующей, что как первичные, так и ранние вторичные фолликулы экспрессировали рецептор ФСГ и транскрипты DAZL.
Иммунофлуоресцентная локализация CX37 в изолированных преантральных фолликулах как на первичной, так и на ранней вторичной стадиях показывает, что CX37 локализовался в плазме O, отсутствуя в ядре O-сайта и в мембране клеток гранулезы. По нашему опыту, правильное рассечение тонкого слоя кортикальной ткани, измельчение ткани до нужного размера и правильная гомогенизация являются критическими шагами для обеспечения высвобождения жизнеспособных фолликулов из ткани. Изолированные преантральные фолликулы могут быть использованы для ответа на такие вопросы, как регуляция роста преантрального фолликула и характер взаимодействий между клетками гранулезы и ооцитом, тем самым способствуя развитию более эффективных условий культивирования.
