Aislamiento de pequeños folículos preantrales del ovario bovino mediante una combinación de fragmentación, homogeneización y filtración en serie

Este protocolo permite el aislamiento eficiente y repetible de folículos preantrales en etapa temprana de un solo ovario bovino y crea nuevas oportunidades para el estudio de la foliculogénesis ovárica en una especie no bovina. Al utilizar un mayor número de folículos de un solo ovario, esta técnica permite tratamientos in vivo antes de la recolección de ovarios, u obtención de múltiples muestras a lo largo del tiempo del mismo animal mediante biopsia ovárica. El aislamiento y la criopreservación de los folículos preantrales en etapa temprana pueden ser una opción valiosa para la preservación de la fertilidad en mujeres jóvenes sometidas a tratamiento gonadotóxico como la quimioterapia, así como la preservación de germoplasma de especies en peligro de extinción.

Demostrando el procedimiento estarán Stephanie McDonnell, Amanda Morton y Juliana Candelaria, estudiantes de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar, transfiera los ovarios en el laboratorio a PBS cálidos y estériles que contengan Pen-Strep y seleccione ovarios con muchos folículos antrales pequeños y sin cuerpo lutecio prominente. Retire cualquier exceso de tejido conectivo y grasa de los ovarios con tijeras.

Transfiera un ovario a la tabla de cortar en el papel de banco. Usando un bisturí, corte el ovario por la mitad longitudinalmente desde un sitio de unión del ligamento al sitio de unión opuesto. Mantenga una mitad del ovario en la tabla de cortar para ser procesada y coloque la otra mitad del ovario nuevamente en PBS caliente que contenga Pen-Strep.

Para eliminar la médula, corte a lo largo de la curvatura del ovario aproximadamente a 2 milímetros de distancia de la superficie sin cortar a través de la corteza con la médula expuesta hacia arriba. Corte hacia abajo a través del corte para eliminar la mayor parte de la médula. Voltee el ovario hasta la mitad para que el epitelio mire hacia arriba y use el bisturí para terminar de cortar la médula lejos de la corteza y recorte cualquier tejido conectivo blanco restante alrededor del borde de la pieza del ovario que estaba conectada a los ligamentos.

Una vez que se extirpa la mayor parte de la médula, use el bisturí para cortar la corteza a aproximadamente 1 milímetro de grosor mientras manipula el bisturí con pequeños movimientos de ida y vuelta para afeitar el resto de la médula, luego corte cada corteza ovárica por la mitad en dos pedazos. Mantenga las piezas de la corteza en PBS caliente que contiene Pen-Strep hasta que estén listas para cortar. Transfiera una sola pieza de la corteza a la placa de Petri en el picador de tejido y humedezca el tejido con tres o cuatro gotas de PBS caliente que contiene Pen-Strep.

Mientras mantiene el pedazo de tejido firme con un par de pinzas, presione el botón Reset una vez para iniciar el cortador de pañuelos. Después de que toda la pieza de la corteza se haya cortado en tiras, use la perilla del soporte de la cuchilla para levantar la cuchilla de la placa de Petri y las pinzas para eliminar cualquier tejido de la cuchilla. Después de girar el soporte de la placa 90 grados, nuevamente, presione el botón Reset y pase la cuchilla completamente a través de las tiras de pañuelo.

Use la perilla del soporte de la cuchilla para levantar la cuchilla de la placa de Petri y las pinzas para eliminar cualquier tejido de la cuchilla como se demostró anteriormente. Usando una pipeta de transferencia y PBS caliente que contenga Pen-Strep, lave el tejido picado en un tubo cónico de 50 mililitros precalentado. Regrese el tubo cónico al baño de agua o cuentas para mantener caliente el tejido picado mientras repite el procedimiento de corte con las otras tres mitades del ovario.

Para obtener los mejores resultados de corte, use el controlador de tuercas para quitar la tuerca del brazo de corte y retire la arandela y el cierre de la cuchilla. Con pinzas, retire la cuchilla del brazo cortante. Voltérelo para que el borde no utilizado quede hacia la placa de Petri y colóquelo de nuevo en el brazo de cortar.

Después de asegurarse de que la unidad homogeneizadora esté enchufada y la velocidad esté ajustada a la segunda barra, inserte la sonda del generador de 10 milímetros en la unidad de acuerdo con las especificaciones del fabricante. A continuación, configure un temporizador durante 1 minuto e inserte la sonda en el tubo cónico de 50 mililitros que contiene el tejido cortado de la corteza de un ovario y suficiente PBS que contiene Pen-Strep para llenar el tubo hasta la línea de 25 mililitros. La profundidad a la que se inserta la sonda debe ser 1/3 de la altura del líquido medida desde el fondo de la cámara.

Una vez que se inicie el temporizador, encienda el homogeneizador, asegurándose de que la parte inferior de la sonda no toque el tubo y mantenga el tubo quieto mientras el homogeneizador está encendido. Después de 1 minuto de homogeneización, retire la sonda del tubo, luego retire cualquier tejido conectivo que obstruya los orificios de ventilación en el espacio entre la cuchilla del rotor y el tubo del rotor o las piezas de la corteza atrapadas en la sonda con pinzas y colóquelas nuevamente en el tubo. Verter el tejido disperso en el embudo cubierto de gasa, insertarlo en el erlenmeyer y enjuagar el contenido del tubo en el embudo con PBS tibio.

Finalmente, enjuague la gasa con PBS caliente. Forzar el líquido en pequeños fragmentos para que pase a través de los agujeros de la tela girando la gasa alrededor de los fragmentos de tejido hacia abajo y apretando hasta que todo el exceso de líquido y tejido se elimine de la gasa. Después de volver a abrir la gasa sobre el embudo, enjuague la gasa con PBS que contenga Pen-Strep con una pipeta de transferencia y, nuevamente, exprima cualquier fragmento de tejido residual a través del paño.

Con un hemostático, sostenga el filtro celular de 300 micrómetros sobre un vaso de precipitados de 200 mililitros y vierta el filtrado en el matraz Erlenmeyer a través del filtro celular. Si el colador de células se obstruye con tejido, golpee suavemente contra el vaso de precipitados, luego gire el colador boca abajo y golpee los restos de tejido grandes en el papel de banco. Enjuague el contenido del matraz con PBS tibio que contenga Pen-Strep hasta que no queden fragmentos de tejido y viértalo en el colador celular.

A continuación, mientras sostiene el filtro celular de 40 micrómetros con un hemostático sobre un segundo vaso de precipitados de 200 mililitros, vierta todo el filtrado inicial presente en el primer vaso de precipitados de 200 mililitros a través del filtro, luego enjuague el contenido del vaso de precipitados con PBS caliente que contiene Pen-Strep hasta que no queden fragmentos de tejido y viértalo en el filtro celular. Después de colocar la aguja de calibre 18 en la jeringa de 20 mililitros, llene la jeringa con medio de lavado de folículos. Con un hemostático, sostenga el filtro de células de 40 micrómetros boca abajo sobre una placa de Petri cuadrada y use la jeringa para lavar el contenido del filtro celular en el plato.

Transfiera la placa de Petri cuadrada a un estereoscopio con una etapa cálida establecida a 38.5 grados centígrados con un aumento establecido entre 1.25 y 3.2x. Después de identificar los folículos de la placa de Petri cuadrada, transfiera el folículo para lavar las gotas medianas con la micropipeta. El número total de folículos preantrales aislados por réplica utilizando homogeneización tisular de 6 minutos muestra un promedio de 41 folículos por réplica, que van de 11 a 135 folículos.

La evaluación de la etapa de desarrollo de 476 folículos aislados mostró que la mayoría estaban en la etapa primaria de desarrollo, midiendo de 40 a 79 micrómetros en contener una capa de células de granulosa cuboidal. La homogeneización de la corteza ovárica durante 6 minutos produjo un mayor número de folículos preantrales en comparación con 5 minutos de homogeneización a la misma velocidad. La expresión de la transcripción del receptor FSH del marcador celular de la granulosa y del marcador de células germinales DAZL en los folículos se evaluó mediante PCR cuantitativa con transcripción inversa que demuestra que tanto los folículos primarios como los secundarios tempranos expresaron transcripciones del receptor de FSH y DAZL.

La localización inmunofluorescente de CX37 en folículos preantrales aislados tanto en la etapa primaria como en la secundaria temprana muestra que CX37 se localizó en el plasma O, estando ausente del núcleo del sitio O y de la membrana de las células de la granulosa. En nuestra experiencia, la disección adecuada de una capa delgada de tejido cortical, cortar el tejido al tamaño correcto y la homogeneización adecuada son pasos críticos para garantizar la liberación de folículos viables del tejido. Los folículos preantrales aislados se pueden utilizar para responder a preguntas como la regulación del crecimiento del folículo preantral y la naturaleza de las interacciones entre las células de la granulosa y el ovocito, facilitando así el desarrollo de condiciones de cultivo más eficientes.