이러한 프로토콜을 통해 조사관은 단순히 미토콘드리아 산소 소비량을 측정하는 것을 넘어 주요 미토콘드리아 최종 산물인 ATP 및 활성 산소 종의 측정을 허용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구자가 산소 소비율을 최종 제품 생산 속도와 직접 비교하여 미토콘드리아 효율성을 측정할 수 있다는 것입니다. 최종 생성물이 ATP인지 활성 산소인지 여부.
이 기술은 특히 기포를 피하기 위해 세부 사항에 매우 세심한 주의가 필요합니다. 호흡실에 있든 적정 주사기에 있든 기포는 측정의 정확성을 떨어뜨리기 때문에 적입니다. 골격근 생검을 얻은 후.
호흡계 챔버를 마그네슘이 없는 배지로 채우고 배양 챔버를 밀봉합니다. 말 골격근의 기저 온도를 나타내기 위해 기구 배양 온도를 섭씨 38도로 설정합니다. 호흡 매체의 혼합을 호흡계 챔버의 바닥에서 회전하는 자석 교반을 사용하여 750 rpm으로 설정한다.
그런 다음 형광 센서와의 간섭을 피하기 위해 챔버 조명을 끕니다. 800mV 분극 전압으로 산소 전극에 전원을 공급하고 이득 설정 1로 결과 신호를 증폭합니다. 2초마다 산소 농도를 기록하고 40초 동안 진행된 산소 측정의 음의 기울기로 산소 플럭스를 계산합니다.
그런 다음 매체가 실내 공기와 평형을 이루도록 하여 산소 센서를 보정합니다. 고해상도 호흡계로 측정한 기압과 표준 대기 산소 농도를 기준으로 기준 산소 분압을 계산합니다. 녹색 형광 센서를 사용하여 호흡실의 형광 신호를 정량화합니다.
400 - 500 밀리볼트에서 센서에 전원을 공급하면 결과 신호가 1 - 1, 000의 이득으로 증폭됩니다. 다음으로, 미토콘드리아를 추가하기 전에 호흡 챔버에 TMRM을 추가하고 미토콘드리아를 추가하기 전에 추가된 형광단의 양에 대한 형광 신호의 간단한 2점 보정을 사용하여 형광 신호를 보정합니다. 미토콘드리아 막 전위의 완전한 붕괴를 나타내는 TMRM 형광 신호의 추가 증가가 관찰되지 않을 때까지 분리제의 여러 적정을 전달하여 호흡 측정 적정 프로토콜 완료 후 TMRM 신호의 최종 보정을 수행합니다.
청색 형광 센서를 사용하여 호흡실의 형광 신호를 정량화하고 개별 기기에 대해 이러한 센서에 전원을 공급하여 센서의 선형 범위 내에서 예상되는 신호를 캡처합니다. 8 마이크로 리터의 2 밀리몰 EDTA를 호흡 챔버에 첨가하여 마그네슘 이온과 경쟁하여 마그네슘 그린에 결합하는 양이온을 킬레이트화합니다. 그런 다음 4 마이크로 리터의 1 밀리몰 마그네슘 그린을 호흡 챔버에 추가합니다.
100 밀리몰 염화마그네슘의 10 x 2 마이크로리터 순차 적정으로 원시 형광 신호를 보정하고, 적정 사이에 1분 동안 형광 신호를 안정화합니다. 프로토콜 전반에 걸쳐 시간 경과에 따른 ATP 농도의 기울기인 ATTP 합성 속도를 결정합니다. 녹색 형광 센서를 사용하여 호흡실의 형광 신호를 정량화합니다.
300-400 밀리볼트로 센서에 전원을 공급합니다. 그리고 결과 신호는 1에서 1, 000의 이득으로 증폭됩니다. 개별 계측기에 대한 특정 설정을 최적화하여 센서의 선형 범위 내에서 예상 신호를 캡처합니다.
미토콘드리아를 추가하기 전에 Amplex UltraRed Assay의 화학적 설정 및 초기 보정을 수행합니다. 반응을 방해할 수 있는 양이온을 킬레이트화하기 위해 30마이크로몰의 DTPA를 추가합니다. 그런 다음 호흡 측정 챔버에 superoxide dismutase 또는 serratus peroxidase 및 Amplex UltraRed를 추가합니다.
형광 신호가 안정화되도록 합니다. 그런 다음 0.2 마이크로 몰의 과산화수소를 5 분 간격으로 두 번 첨가하십시오. 조사자의 재량에 따라 이러한 보정 지점의 특정 타이밍과 함께 분석 전반에 걸쳐 호흡 측정의 화학적 성질이 변경됨에 따라 분석의 반응성을 조정할 수 있도록 분석 전반에 걸쳐 추가 2점 보정을 수행합니다.
샘플을 와동시켜 균일한 샘플 현탁액을 유지하고, 15 마이크로리터의 단리된 미토콘드리아 현탁액을 각각의 2 밀리리터 배양 챔버에 첨가하여 결과가 18.75 밀리그램의 근육의 미토콘드리아 수율을 나타내도록 한다. 기질을 추가하기 전에 잔류 산소 소비량을 측정하고 완료 후 기질 비결합 억제제 적정 또는 SUIT 프로토콜의 각 단계의 산소 소비량 값에서 이 값을 뺍니다. 말 골격근 미토콘드리아 기능의 초기 특성화를 허용하는 범용 SUIT를 사용하십시오.
피루브산, 글루타메이트 및 말산염을 각 챔버로 순차적으로 적정하여 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드를 생성하고 복잡한 1 기반 누출을 통해 산화된 NADH에 의해 지원되는 비인산화 호흡을 자극합니다. 그런 다음 ADP를 추가하여 복잡한 인산화 호흡을 통해 인산화 호흡을 자극합니다. 숙신산을 첨가하여 복합체 1과 복합체 2를 결합하여 인산화 호흡을 생성하고 복합체 1을 차단하기 위해 로테논을 추가합니다.
생성된 산소 플럭스는 숙시네이트 단독의 산화에 의해 미토콘드리아 산소 소비를 지원하는 복합체 2의 용량을 나타냅니다. 말 골격근, 미토콘드리아 호흡 및 상대적인 막 전위의 고해상도 호흡 측정 흔적이 표시됩니다. TMRM과 함께 배양된 미토콘드리아의 호흡 값은 해당 형광단의 억제 효과로 인해 더 낮습니다.
미토콘드리아 호흡 및 ATTP 합성은 높은 비율의 미토콘드리아가 풍부한 제1형 골격근 섬유를 함유하고 휴식 대사에 가까운 조건에서 배양된 말 골격근의 합성을 나타낸다. 말 골격근, 미토콘드리아 호흡 및 과산화수소 생성의 호흡 측정 흔적이 표시됩니다. 고해상도 호흡 측정법은 많은 인내가 필요합니다.
분석을 실행하는 사람은 정상 상태에 도달했는지 여부와 다음 단계가 발생할 수 있는지에 대한 판단을 내려야 하는 수많은 시점을 갖게 됩니다. 지금까지 단 하나의 적정 프로토콜만 시연했습니다. 미토콘드리아 대사에 관한 특정 질문을 해결하기 위해 동일한 방식으로 적용할 수 있는 수십 가지 프로토콜이 더 있습니다.
