病毒遗传背景明确的神经回路跟踪

摘要

跟踪突触连接的神经元的方法。我们使用TVA特异性的上游电池，探测是否感兴趣的接收的细胞群体突触输入从基因定义的细胞类型。

摘要

古典方法研究神经回路是相当低的吞吐量。病毒跨突触，特别是伪狂犬（PRV）和狂犬病毒（RABV），，最近水泡性口炎病毒（VSV），学习电路，正变得越来越流行。这些高通量的方法使用顺行或逆行方向的神经元之间传递的病毒。

近日，RABV突触逆行追踪。 （ 图1A）。在这种方法中，糖蛋白（G）的基因被删除从病毒基因组中，仅在目标神经元和补给。感染特异性达到代的嵌合G，ASLV-阿糖蛋白和胞质域的RABV-G（A / RG）的胞外结构域组成，正常RABV-G ^1。特别是感染这种嵌合G TVA受体^1的表达。该基因编码TVA已经Delivered通过各种方法^2-8。 RABV-G感染的TVA表达神经元，RABV可以传输到其他突触连接的神经元在逆行方向的性质，这是交付的TVA受体的G。这种技术标签相对大量的输入^{（5-10％）2}到一个定义的细胞类型，提供了一个采样到一个定义的起动器的细胞类型中的所有的输入。

我们最近修改了这个技术的使用VSV作为一个跨突触示踪^9。 VSV有几个好处，包括快速的基因表达。在这里，我们详细介绍了新的病毒跟踪系统，使用VSV有用的探测微型电路与更高的分辨率。在原来的出版策略，由威克沙姆等^。4和贝尔等人^。9许可证标记神经元的任何项目上最初感染TVA-表达细胞，在这里VSV被设计仅传输到电视A-细胞（ 图1B）。该病毒是第一个假RABV-G允许感染下游TVA表达神经元的神经元。这个第一群细胞感染后，病毒发布只能感染TVA-表达细胞。由于跨突触的病毒传播是有限的TVA-细胞的自定义类型的细胞连接的情况下，存在可以被探索和高分辨率。这些实验是在图2中所示的实验流程图。在这里，我们展示一个模型电路，在小鼠视网膜的方向选择性。我们考察爆无长突细胞（SACS）的连通性视网膜神经节细胞（RGC）。

研究方案

1。使病毒从cDNA恢复的VSV的cDNA使用牛痘-T7系统¹⁰

1. 前一天进行实验，分割成60毫米菜含有DMEM + 10％FBS BsrT7细胞。每道菜的种子2E6细胞。 BsrT7细胞来源于BHK21，或幼仓鼠肾细胞。
2. 暖用1mM镁和1mM氯化钙的PBS至37℃。
3. 获取一个小等分vTF7-3，表达T7聚合酶的牛痘病毒，和解冻至室温。 vTF7-3是一种传染性的牛痘病毒表达T7聚合酶^11，并应使用仅在生物安全级别2遏制。这种表达系统是用来产生所需的转录从质粒转染在步骤1.9的最大水平。涡病毒在最大速度为30秒。为2分钟，在室温下在水浴中超声在台式超声波发生器。涡再次，持续30秒打破了病毒的团块。
4. 删除媒体从BSRT7细胞。
5. 11.7微升vTF7-3到第600微升PBS与镁和钙，并添加到细胞的混合物。
6. 移动板成34℃培养箱中，用5％的CO _2。岩板轻轻每10分钟一次。
7. 经过45分钟后，开始转染。加入20μL脂质体转染法2000到1毫升DMEM和组合。等待5分钟。
8. 加入5.25微克pN时，PP 2.3微克，1.2微克复数，1微克pCAG RABV-G，和6μg的VSV基因组cDNA到500μlDMEM培养基。 PN，PP和pl质粒驱动下的T7启动子¹⁰的VSV病毒基因的表达，与根据经验确定的量的病毒的最佳救援。
9. 结合管和混合。等待15分钟，在室温下。
10. 删除PBS洗的盘子，用1.5毫升DMEM。
11. 吸冲洗介质。转染混合物板。移动板为34℃培养箱中培养。
12. 等待5个小时，然后取出介质。
13. 改变介质至4毫升DMEM + 2％FBS + 1个青霉素，链霉素+ 10 mM HEPES的pH值7.4。添加Penicillin - 链霉素，以防止污染，和HEPES，以维持pH的媒体，是非常重要的。 FBS含量可降至2％，被破坏的细胞在短短几天的病毒，因此不需要10％FBS。
14. 将板为34℃培养箱中培养48-72小时。
15. 收藏报错媒体在第3和转染后6天，并立即通过一个0.20微米的过滤器的过滤器的注射器。这个尺寸的过滤器除去的牛痘病毒，但不VSV。
16. 既然我们要提供RABV-G的病毒包膜，和基因组不编码RABV-G基因，它必须不断地供给反要做到这一点，使一个单独的盘的：293T TVA800（TVA800）细胞。这些细胞是组成型表达TVA受体，允许ENVA介导的病毒感染^12。在80％汇合时，更改只媒体到DMEM，然后转染的细胞，用5μg的质粒编码G蛋白（ 即 pCAG RABV-G），每块板。我们用PE我转染试剂，聚阳离子聚合物，它是便宜得多的可比脂质为基础的方法。然而，脂质体转染法也可以用来有效地用于此目的。最佳PEI：DNA的比例需要根据经验来确定。在另一项实验中， 即 pCAG GFP的荧光记者。我们使用10微升PEI：4微克DNA。
17. 应用从步骤16到转染的板TVA800细胞上清液。
18. 观察这个板块的翌日病毒表达荧光的荧光的证据。首次观察到病毒的荧光作为一个单一的单元格中，并且随着时间的推移（ 即 图3）逐渐传播。该病毒在几个小时内蔓延。

2。 VSV的通道和浓度

1. TVA800细胞分割成含DMEM + 10％FBS这样，你将有4个10厘米〜80％汇合第二天板。由于他们的高转录293T为基础的电池的工作原理sfectability TVA-表达细胞，并且使用增强的速度，在盘的细胞被感染。其他高效转染的细胞系可以达到同样目的。
2. 在80％融合，改变媒体的DMEM，然后用5μg您要使用的（ 即 pCAG RABV-G）每板的G蛋白的质粒转染的细胞。我们使用PEI，但FUGENE的/脂质体的工作为好。
3. 等待一天后，转糖蛋白的表达/表面积累。更改媒体（5毫升/板），然后到DMEM + 10％FBS的感染与rVSV病毒（A / RG），在0.01
4. 检查24小时后的感染量。你应该看到感染的细胞（由GFP荧光标识），一些与感染的细胞（ 即 图3）的周边补丁。通常情况下，这是唯一值得收集上清液，如果你看> 50％的细胞受到感染，否则病毒滴度obtained的浓度将是最理想的。
5. 如果> 50％，收集5毫升，媒体/板，并更换新鲜的培养基中，用5毫升的。如果太少的细胞被感染，另一个等待12-24小时，并再次检查。冻结收集的上清液在-80℃下
6. 收集每24小时后3天，4天，总。
7. 总之，如果你开始有4个板块，你应该有媒体每天20毫升 - 所以80毫升总，或价值2超速离心管的上清液。解冻后的上清液在37℃下，使用超过0.45微米的过滤器在冰上。等分试样36毫升的病毒到Beckman离心机管。
8. 浓缩上清液（21,000 K的一个SW28转子（= 80,000 xg离心）90分钟）在4℃下到含有10％的漂白剂的烧杯中，滗析出上清液，同时管被反转，使用抽吸器除去尽可能多的媒体从侧管尽可能。
9. 在覆盖。动摇病毒管在4℃下1小时。在阿布一个标准的振动筛吨120 rpm是足够的。
10. 轻轻捣碎沉淀，剩余的介质，轻轻上下吹打30次。要小心，不要引入气泡。剩余的媒体数量应约30微升。此卷为多管分装，以避免多次冻融循环对任何特定的股票，因为这可能会导致在病毒滴度下降。可以冻结这些等分试样在-80℃下
11. 滴度的病毒。在大约2天感染后滴定是最优的。最初的感染可在一小时内就可以观察到，但你会得到一个代表名额不足的滴度，如果你等待的只有1天。为了获得的病毒滴度，进行限制性稀释浓缩的病毒实验到在24孔板中的合适的细胞系（293T细胞中很好地工作），稀释10倍的病毒从第1至1：1,000,000。我们得到的效价通常是在^{10 8} -10 10焦点形成单位（FFU）/毫升的范围内。

3。维尔我们注射

1. 我们使用的小鼠之间，通常在6-10周龄，这些实验。任何年龄建立后，电路就足够了。我们会选择从视网膜神经节细胞（RGC）的传输到爆的无长突细胞（SACS）为例。本实验中，在图2中的框图，需要一个三元组的转基因动物，只有一个单一的注射的病毒。 （所有程序批准的IA​​CUC在哈佛医学院，按照与机构的指导方针）。
2. 首先，需要以产生适当的动物。我们的目标是有TVA表达的细胞类型中的一个人希望映射到的病毒（ 如腺病毒相关病毒，AAV）的装置，通过，或通过转基因的等位基因。 Cre表达的细胞类型特异性通常是通过以下方式获得。在这里，我们也越过TVA在条件表达式中等位基因⁷胆碱乙酰转移酶（CHAT）中铁快运等位基因^13，TVA表示在一个的Cre表达历史记录（诊所）与所有细胞。我们也越过一个条件表达式tdTomato的等位基因（R26TdT）的TVA-细胞可视化。
3. 注入位置的坐标为需要确定。这些坐标的利益，可以发现在脑图谱， 即富兰克林和Paxinos鼠脑图谱^14。这些坐标需要注意的小鼠颅骨相对于一个给定的地标。我们使用前囟门，但任何坐标系是足够的。
4. 准备立体定位仪。打开的微量注射器控制器上，并移动的柱塞和电极座入到位。然后回到与矿物油填充的注射针，提供一个接口，与病毒。把唱针，然后到柱塞上，确保没有气泡留在针。
5. 解冻的病毒，并将其放置在冰上，以防止病毒滴度下降。将微量注射器“退出”，将管的病毒，是contacti在毛细管上的微量注射器。 RABV-G假rVSV（A / RG）的实验中提取必要的量。
6. 动物被给予手术前剂量的丁丙诺啡（0.05-0.1毫克/公斤），在手术开始之前。对于麻醉动物，无论是异氟醚吸入，或腹膜内注射氯胺酮（40-80毫克/千克）和甲苯噻嗪（5-10毫克/千克）的混合物是足够的。麻醉剂的选择是依赖于用户。脚趾夹，然后执行，以确保动物是完全麻醉，如果动物没有反应，你可以继续程序。使用这些药物之前，请务必以获得适当的许可。
7. 动物被放置在加热垫，支撑一个可移动的支架上，用于定位鼠标。动物仍然存在在整个外科手术的持续时间。应用眼药膏，以防止角膜干燥，而动物麻醉。
8. 鼠标的头部，然后需要稳定的立体一个pparatus。使用耳杆的立体定位仪上，以确保头部彻底担保，使得头部与地面平行，和不旋转横向。一旦这项工作完成，调整咬栏，以帮助稳定头。
9. 动物的皮毛被剃光头顶上在该地区的切口。此区域，然后用乙醇洗涤三次，接着用碘由三次。一个切口，然后用手术刀在皮肤上，露出了头骨。
10. 鼠标和注射设置一旦准备好了，前囟门必须位于。这是该领域中的头部的中心，在矢状面和两个冠状缝满足。一旦此区位于，立体定位仪上的刻度盘可以被用于调节到适当的坐标的微量注射器。在这里，我们注入外侧膝状体（LGN），使用坐标A / P，L / M 2，D / V 2.75 -2.46从囟。
11. 一旦坐标已经被拨号时，钻头必须进行汇编。将钻头钻钻，然后打开。一个小的孔应钻成的站点确定为注射部位。很温柔的演习中，以不引起脑实质的损害。当骨非常薄，硬脑膜血管变得清晰起来。在这一点上，仔细穿孔开颅的边缘与一个小的（30表压）的针和罚款（＃5）的钳子，以除去剩余的骨。
12. 调整毛细管孔钻的大脑表面，只是背的位置。针头应该是足够清晰的穿透硬脑膜轻松的。然后针降低到所需的深度，并开始注射。我们注入病毒在100升/分钟的速率。
13. 这一点的注射程序需要大致10分钟。注射后，针保持在大脑中约七分钟。这是至关重要的，因为它允许从注射部位的病毒扩散。快速去除针形，麟蹄ction网站的查询结果在降低在注射部位的感染效率，并沿针道感染。
14. 将针从注射部位，非常缓慢地升至跨度超过大约两分钟。这又是打算沿针道，以减少感染。
15. 一旦移除，然后缝合皮肤。动物连续监测，直到他们从麻醉中恢复过来。丁丙诺啡（0.05-0.1毫克/公斤），每12小时2天。

4。收获组织/组织准备

1. 对于收获感兴趣的组织中，最佳时间取决于实验的目标。一般来说，VSV跨突触传播可以先观察到小于24小时后喷射。然而，等待更长的时间，会导致更多的传播。
2. 要收获的视网膜，动物是第一个安乐死，使用吸入二氧化碳和颈椎脱位执行。眼球然后除去，放入的管浓度含在PBS中的4％多聚甲醛在室温下1小时。
3. 在眼球上，然后放置到陪替氏培养皿，用PBS。视网膜解剖远离其他组织。
4. 对于整装分析，视网膜被切断，平躺着，放到载玻片上，然后安装延长黄金的安装媒体，并覆盖着一个零厚度的盖玻片。在视网膜上的压缩力，以尽量减少载玻片和盖玻片之间放置硅衬垫。对于截面分析，被放置在视网膜视网膜淹没在PBS中，直到30％的蔗糖。然后放入50％的OCT的混合物和50％30％蔗糖溶液中3小时。然后闪烁冻结，并保持在-80℃，直到准备切割。

5。代表性的成果

应该能够从cDNA拯救的病毒感染TVA800细胞，但不是293T细胞（ 图3）。供应RABV-G可以感染多种细胞吨YPES，包括293T。然而，由于基因组中的基因组编码的A / RG，细胞间传播发生在TVA-表达细胞中的高得多的速率。

一旦病毒浓缩，典型的10 ⁸ FFU / ml和10 ¹⁰ FFU / ml的滴度范围之间。用于在体内这些滴度是足够的。

到小鼠在LGN注射过程中，我们不区分背LGN（背外膝体）从腹侧LGN（vLGN）的，通常都被感染。因此，多个RGC的类型成为标记（ 图4），包括那些项目的vLGN，如melanopsin的视网膜神经节细胞（ 图4D）和ON-DSGCs（ 图4E），以及那些项目的后背外侧膝状体，如小乔木视网膜神经节细胞（ 图4C）和ON-OFF-DSGCs（ 图4F）。虽然不止一种类型的RGC传播病毒到物质误用诊所，在其他地方（贝尔等人 ，在审查），在这里我们只关注研究ON-OFF-DSGCs的连接到物质误用诊所。

当我们注入小鼠的基因型cTVA（+）/聊天中铁快运（ - ），在没有TVA应表示，只有视网膜神经节细胞标记（ 即 图4）。这是由于由视网膜神经节细胞的RABV-G假型病毒的初始摄取，而没有扩散发生。无视网膜神经节细胞被感染的LGN感染的rVSV，（A / RG）病毒RABV-G不假，由于这些病毒颗粒无法横向长这些视网膜神经节细胞轴突。但是，当注射cTVA（+）/（+）（和R26TdT（+））ChATCre小鼠成的LGN，病毒扩散并发生，只有红色的细胞，该细胞表达的Cre记者（ 即 图5）。这些细胞也共同标签与抗ChAT抗体，仅在两个ChAT的薄层和分层作为评估中心服务（ 图5B'，C'），确认其身分。每DSGC病毒标记的物质误用诊所的数量从一到九之间。

图1跨突触。我们的逆行追踪系统相比最初的开发方法。 （A）（i）在开发由威克沙姆和他的同事的方法，“起动细胞转染与这三种基因的TVA受体，允许感染，特别是转染细胞; RABV-G，用于补充RABV本身有G基因删除;和红色荧光蛋白，以确定转染细胞。 （ 二 ）的RABV假的A / RG蛋白感染TVA-细胞，使它们黄色的。 （ 三 ）发生逆行跨突触传递到上游的神经元。 （B）（ⅰ），在我们的方法中，TVA-表达细胞定义的基因，与一个有条件的红色荧光蛋白A，并标示为英寸（ⅱ）“起动机细胞”是指由一个VSV病毒基因组中的基因编码的A / RG感染。这些初始细胞不表达TVA受体。 （ 三 ）逆行跨突触传递只有当这些细胞发生TVA表达神经元突触输入的首发神经元上。 点击此处查看大图 。

图2的实验步骤的示意图。 （A）首先，病毒从cDNA救出。然后传代RABV-G假型化，并浓缩和滴定。此病毒，然后注射到大脑，在那里它被允许孵育期望的时间段内。在此之后时间，眼睛被收获，和视网膜的解剖和分析。 （B）RABV-G假型病毒的原理图。这是必要的视网膜神经节细胞从大脑注射感染。 RABV-G基因转染组织培养细胞中表达的TVA受体。然后，这些细胞的的A / RG（rVSV）的病毒感染。释放的病毒粒子，将有RABV-G在病毒包膜，但不会有RABV-G基因的病毒基因组中。 （C）的示意性的鼠标穿过必要三重的转基因动物。有条件的TVA和tdTomato等位基因的交叉到Cre重组酶的选择，比如，TVA和tdTomato都表示只有在细胞中Cre表达历史与驱动程序。在这个例子中，我们的聊天中铁快运。 （D）的视网膜感染的示意图，以便追踪DSGC-SAC电路。 ChAT的细胞作出明示TVA和tdTomato的，如在（C）所示。从LGN在视网膜神经节细胞被感染（B）中产生的病毒的fection。由于病毒表达绿色荧光蛋白，，这些视网膜神经节细胞将是绿色。然后，该病毒会传播只TVA表达ChAT的无长突细胞，如果它们连接到标记RGC。这些细胞将是红色和绿色或黄色的。 点击这里查看大图 。

图3。的rVSV病毒（A / RG）上293T和TVA800细胞的行为。这些细胞被感染低：滴度rVSV（A / RG）与RABV-G假型。该病毒之间的利差TVA-细胞在几个小时内，感染后6小时（HPI），感染后2天（DPI）所示。然而，293T细胞，不表达TVA受体的蔓延，虽然我吨确实发生，发生慢得多。比例尺= 100微米。

图4代表非TVA表达小鼠的视网膜神经节细胞的感染。动物注射到LGN的rVSV（A / RG）RABV-G假型病毒，组织收获2 DPI。 （A）的稀疏（视网膜神经节细胞由黄色箭头表示），或（B）感染可以得到致密的，这取决于病毒的滴度和注射质量。根据形态，包括（C）小乔木视网膜神经节细胞（D）1型黑视素的视网膜神经节细胞（E）ON-DSGCs“，和（F）ON-OFF-DSGCs，其中包括许多不同类型的视网膜神经节细胞可以识别。比例尺= 50微米。

图5。rVSV（A / RG），从ON-OFF-DSGCs的物质误用诊所传输遵循预期的模式。 （A）ON-OFF-DSGCs（白色箭头与绿色填充）传播病毒到多个气囊（黄色箭头）。 （A'）。不是所有绿色细胞的Cre记者DSGC合作标签，这表明它们是表达TVA-评估中心服务。 （BC），DSGC（绿色填充白色箭头）及特别评估中心（黄色箭头）在适当的分层聊天层的视网膜内丛状层（IPL）。细胞的病毒传送ON和OFF-物质误用诊所。面板中的B'，C'的数字表明IPL的纹层。 DSGC胞体的位置仅由箭头表示，但面板 C中未示出，以反白显示的SAC。比例尺= 50微米。

讨论

使用病毒来研究神经回路是一个相对较高的吞吐量，连接神经元的分析方法。但是，生成，VSV和RABV病毒颗粒是不平凡的。虽然提供了上面列出的用于从cDNA拯救病毒的协议，它仍然是一个低概率事件。水平的每一个的N，P和L的质粒中需要被精确地调整，需要做的工作，以确保病毒救援和许多试验和复制。将一个完整的VSV基因组RNA的核苷酸颗粒的形成是一个低概率事件，因此可能需要多次尝试。这?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Culture
Baby Hamster Kidney (BSRT7) cells	available upon request
vaccinia (vTF7-3)	available upon request
pN, pP, pl plasmids	available upon request
Calcium Chloride	Sigma	C1016
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
HEK 293T cells	Open Biosystems	HCL4517
60 mm TC-Treated Culture Dish	Corning	430166
75 cm2 Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap	Corning	430641
Media : DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Invitrogen	12491-015
1 M HEPES pH 7.4	Gibo	15630-080
FBS: Fetal Bovine Serum	Gibco	10437-028
PKS	Invitrogen	15140-163
Lipofectamine 2,000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668-019
Syringe: 5 ml Luer-Lock syringe	Sigma	Z248010-1PAK
Syringe Filters	Nalgene	190-2520
PEI: High Potency Linear PEI	Polysciences	23966
Viral Centrifugation
Corning 150 ml Tube Top Vacuum Filter System, 0.45 μm Pore	Corning	430314
Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 ml, 25 x 89 mm ultracentrifuge tubes	Beckman-Coulter	344058
Ultracentrifuge	Beckman-Coulter	optima XL-80K
SW28 Ultracentrifuge rotor	Beckman-Coulter	342207
Mouse Injection
Capillary micropipets	Drummond	5-000-2005
Stereotax	Narishige	SR-5M
Micromanipulator	Narishige	SM-15
Ump injector	World Precision Instruments	Sys-Micro4
Four channel microcontroller	World Precision Instruments	UMP3
M.TXB Bench Motor with C.EMX-1 Dial Control, 115 Volt	Foredom	M.TXB-EM
H.10 Handpiece, Quick Change	Foredom	H.10
Step Drill, 0.5 mm	Foredom	A-58005P
Micr–lectrode holder	World Precision Instruments	MEH2S
Ketamine	Henry Schein	995-2949
Xylazine	Henry Schein	4015809TV
Buprenorphine	Henry Schein	1118217
1 ml syringe	Becton-Dickinson	309628
30 gauge injection needle	Becton-Dickinson	305106
Protective Ophthalmic Ointment	Doctors Foster and Smith	9N-014748
Ethanol	Sigma	493511
Iodine	Sigma	PVP1
Surgery and Dissection tools
Scissors	Fine Science Tools	91402-12
Standard Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Fine Forceps	Fine Science Tools	11255-20
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-00
Scalpel handle	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel blades	Fine Science Tools	10015-00
Sutures	Robbins Instruments	20.SK640
Dissection and antibody staining
paraformaldehyde	Sigma	P6148
Phosphate Buffered Saline	Sigma	P4417
Triton X-100	Sigma	T9284
Donkey Serum	Jackson Immunoresearch	017-000-121
Antibodies
Antibodies	millipore	AB144P
Anti-gfp	Abcam	ab13970
Donkey anti-chicken Dylight 488	Jackson immunoresearch	703-545-155
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647	Jackson immunoresearch	705-605-147
DAPI	Invitrogen	D1306
Tissue mounting
Superfrost plus microscope slides	Fisher	12-550-100
Cover glass 22 x 22, 0 thickness	Electron Microscopy Sciences	72198-10
Silicone elastomer	Rogers Corp	HT-6220
Clear nail polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Prolong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36930