使用单纳米粒子暗场显微镜可视化细胞膜上金纳米棒的扩散动力学

摘要

在这里，我们展示了使用传统的暗场显微镜来监测金纳米棒（AuNR）在细胞膜上的动态。使用 ImageJ 和 MATLAB 检测单个 AuNR 的位置和方向，AuNR 的扩散状态以单个粒子跟踪分析为特征。

摘要

分析纳米粒子在细胞膜上的扩散动力学，对于更好地了解细胞吸收过程具有重要作用，为纳米药物输送的合理设计提供了理论依据。单粒子跟踪（SPT）分析可以探测单个纳米粒子在细胞膜上的位置和方向，并揭示其转化和旋转状态。在这里，我们展示了如何使用传统的暗场显微镜来监测活细胞膜上的金纳米棒（AuNR）的动态。我们还展示了如何使用 ImageJ 和 MATLAB 提取 AuNR 的位置和方向，以及如何描述 AuNR 的扩散状态。对数百个粒子的统计分析表明，单个AuNR在U87MG细胞膜表面执行布朗运动。然而，单个长轨迹分析表明，AuNR在膜上有两种截然不同的运动状态，即远程传输和有限区域禁闭。我们的SPT方法可用于研究不同生物细胞的表面或细胞内粒子扩散，并可以成为研究复杂细胞机制的有力工具。

引言

纳米粒子（NPs）在膜上的动力学与细胞吸收过程密切相关，这对了解细胞功能、病毒或细菌感染以及人工纳米医学输送系统^{的发展至关重要。}单粒子跟踪 （SPT） 技术是描述 NP^3、4的异质行为的可靠工具。一般来说，细胞膜是流动的，这意味着蛋白质和脂质等成分可以在等离子膜平面^5、6、7中横向移动。膜组织和结构的空间复杂性可能导致NP和膜之间相互作用的空间异质性。因此，在膜上直接可视化 NP 的运动需要高空间和时间分辨率。

单粒子跟踪显微镜监测活细胞中单个粒子的定位，空间分辨率为几十纳米，时间分辨率为几毫秒，已得到很好的开发，以研究NP或膜分子的动力学^8，9。荧光显微成像技术已成为观测活细胞环境中的NPs/分子的宝贵工具^。例如，总内部反射荧光显微镜，在具有高空间分辨率的基板/溶液接口上对样品的薄层（约100nm）进行成像，已广泛应用于膜分子动力学^13、14的研究。然而，单荧光素的固有缺点，如低强度和快速不可逆的光出血降低了跟踪¹³的准确性和持续时间。因此，取代荧光探头的非荧光质子NP由于其独特的光^学特性，在长期成像研究中越来越受到重视。基于质粒NP探针的散射信号，利用多种光学显微成像技术研究生物过程的机理，如暗场显微镜（DFM）16、干涉学散射（iSCAT）显微镜¹⁷和微分干扰对比显微镜（DICM）18。此外，AuNR的运动和旋转动态可以使用DFM和DICM 18、19、20、21、22获得。通常，在SPT实验中，物体的运动由光学显微镜记录，然后通过SPT分析方法^3进行分析。单个NP产生的定时轨迹和定向角度通常是随机的和异质的，因此有必要用各种分析方法呈现丰富的动态信息。

在这里，我们提供了一个集成协议，使用DFM监控细胞膜上的AuNR的动态，用ImageJ和MATLAB提取AuNR的位置和方向，并用SPT分析方法描述AuNR的扩散。作为演示，我们在这里展示如何使用SPT协议在U87MG细胞膜上可视化未改性AuNR（CTAB-AuNR，由溴化铵分子作为保护剂合成）的动态。研究表明，CTAB-AuNR可以在生物环境中吸收蛋白质，在细胞膜上移动，然后进入细胞^{2，20，22。}U87MG细胞是中枢神经系统最常见、最恶性的肿瘤，其膜受体表达异常。膜受体可以与AuNR上的蛋白质相互作用，影响AuNR的动态。我们的协议通常适用于生物学领域的其他SPT实验。

研究方案

1. 细胞培养

1. 通过添加胎儿牛血清（最终浓度10%）为U87MG细胞准备完整的介质青霉素-链霉素（最终浓度1%）到最低限度的基本介质（MEM）。使用塑料细胞培养皿进行细胞亚培养。
2. 通道单元每周2到3次。
   1. 取出培养基，用杜尔贝科的磷酸盐缓冲盐水（D-PBS）冲洗细胞层2~3倍（80%~90%）。
   2. 在细胞培养皿中加入1.0至2.0 mL的Trypsin-EDTA溶液，在倒置显微镜下观察细胞，直到细胞变圆（3~5分钟）。
   3. 加入3.0 mL的预制完全介质，并通过轻轻吹笛分散细胞。
   4. 将细胞悬浮物（1 mL）加入使用新鲜细胞介质（3 mL）的新培养皿中，然后重新悬浮细胞。
3. 在加湿的大气中将细胞保持在 37 °C 和 5% CO_2。

2. 显微镜幻灯片准备

注:第三代至第十代高活性U87MG细胞用于SPT实验。

1. 通过浸入乙醇（99.9%）对已经用皮兰哈溶液清洗的22毫米×22毫米盖片进行消毒。
2. 使用钳子从乙醇溶液（步骤 2.1）中取出盖滑，并通过在火焰上燃烧乙醇进行消毒。一旦所有乙醇被烧毁，将盖片放入塑料细胞培养皿（35 x 10 mm）中，填充2 mL的细胞介质（无苯酚红色）。
3. 在盖夹上从步骤 1.2.3 中加入 50 μL 的细胞悬架，轻轻来回推盘，左右均匀地分配细胞。将其放置在加湿的氛围中。
4. 当盖夹上的 U87 MG 细胞达到 20%-40% 的汇合度（约 12 小时）时，将 20 μL 的 CTAB-AuNR （138 pM） 添加到菜中并分散。在加湿的大气中孵化5分钟。
5. 在步骤 2.4 中加入 100 μL 的培养介质（无苯酚红色）到凹槽玻璃滑梯的凹槽（图 1），该幻灯片与 Piranha 溶液预清洁。
6. 从盘子里取出盖片，倒置在显微镜玻璃滑梯的凹槽顶部（图1）。用指甲油密封，让它干燥，并将其放在舞台上进行SPT实验。

3. 用暗场显微镜进行单粒子跟踪实验（图1）。

1. 将一滴油放在油浸式暗地冷凝器（NA 1.43-1.20）上，然后转动旋钮，使冷凝器与玻璃滑梯接触。
2. 将一滴油放在盖玻璃顶部，转动对焦旋钮，使 60 倍油浸入目标 （NA 0.7-1.25） 接触油。
3. 打开光源，稍微打开对焦旋钮以聚焦成像平面。
   注:在视野中，背景为黑色，细胞为亮，CTAB-AuNR（纵横比~2:1， 图2）为小颜色（红色、黄色或绿色）散射点。
4. 通过彩色 CMOS 摄像机捕获散射光样本。单击软件中的"相机图标"以记录和导出 TIFF 格式以保存图像。

4. 数据采集

1. 提取单个长期轨迹
   1. 按照 图 3 中的描述操作，将时间系列暗场图像从"RGB 颜色"模式转换为"8 位"模式。在图像 J 中单击 图像|类型|8 位。 要调整对比度，请单击 图像|调整|亮度|对比.
   2. 选择目标粒子，通过拳击切断时间系列背景，然后用"Ctrl+X"删除背景。
   3. 点击"插件|打开粒子检测和粒子链接窗口粒子跟踪器经典|粒子跟踪器"。
   4. 将半径设置为 6，截止到 0，百分位数设置为 0.01%。
      注:要检测粒子，请在预览的帮助下调整以上三个参数。确保半径略大于目标粒子，小于最小的粒子间分离。百分位数是强度分布的下限，是候选粒子。
   5. 将链接范围设置为 5，位移设置为 10。
      注:要将粒子连接在连续相邻帧之间，请调整上述两个参数。位移是粒子在两个后续帧之间移动的最大像素，而 Link Range 是确定最佳对应匹配时要考虑的连续帧数。
   6. 单击"确定"以打开粒子跟踪结果窗口以查看结果。
   7. 单击"可视化所有轨迹"以检查生成的轨迹。
   8. 如果软件生成的轨迹与 AuNR 的移动轨迹不匹配，请单击顶部的"重新链接粒子"菜单，将检测到的粒子重新链接到不同的链接范围和百分位数参数。
   9. 单击"保存完整报告"以保存结果，如果软件生成的轨迹和 AuNR 的移动轨迹匹配。
      注:图4中显示了用图像J提取单个长期轨迹的示 例。
2. 提取多轨迹
   注:图5中显示了与斐济提取多轨迹的示 例。有几个阶段，每个阶段构成了跟踪过程中的一个步骤。每个步骤的结果立即显示，当输出不令人满意时，用户可以返回重新调整设置。
   1. 按照图 3中的描述操作，将时间系列暗场图像从"RGB 颜色"模式转换为"8 位"模式。在图像 J 通路中单击"图像|类型|8位"。要调整对比度，请单击"图像|调整|亮度|对比"。
   2. 点击"插件 |打开启动面板 跟踪|跟踪伴侣"。单击"下一个"。
   3. 从下拉菜单中选择"LoG探测器"，然后单击"下一个"。
   4. 调整探测器配置面板的参数。将估计斑点直径设置为 10，将阈值设置为 0，然后选择"做亚像素本地化"。
   5. 单击"下一个"以打开初始点过滤面板。
      注:可以调整多个参数以进一步优化目标点。在此示例中，未调整其他参数。
   6. 单击"下一步"，从下拉菜单中选择"超级堆栈显示器"。
   7. 单击"下一个"以打开现货过滤面板。将质量设置在 1.88 以上，X 高于 38.86，Y 高于 56.54。
   8. 单击"下一步"，从下拉菜单中选择"简单的 LAP 跟踪器"。通过调整三个参数来配置简单的 LAP 跟踪器，即链接最大距离 = 15、差距关闭最大距离 = 15 和差距关闭最大帧间距 = 5。
      注:链接最大距离是两帧之间点的最大位移。间隙闭合最大距离是两个段的最大位移。间隙闭合最大帧间隙是需要弥合的两点之间的最大帧。
   9. 单击"下一个"以跟踪。完成后，继续单击"下一步"。
   10. 在轨道上设置过滤器，例如在轨道上设置 300 以上的点数。
   11. 继续单击"下一步"，直到最终保存面板打开。从下拉菜单中选择"向XML文件导出曲目"，然后单击"执行"以csv格式保存。
3. R/G 值
   注:R 和 G 通道中目标 AuNR 的散射强度是使用 MATLAB （https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/RGandPolarangle） 中编写的代码从彩色暗场图像中获取的，提取原理在 图 6中显示。
   1. 使用 木协调功能.m 根据 x-y 坐标（由 ImageJ/Fiji 提取）在每帧中查找 AuNR 的中心像素坐标。
   2. 使用 RGextraction 的功能.m划定 3 x 3 像素矩阵，提取 R 或 G 通道的 9 个散射强度值，并计算平均值（μ，定义为 R 或 G）。
      注:3 x 3 像素矩阵以步骤 4.3.1 获得的像素坐标为中心。
4. 极角
   注:极角是AuNR经度和光轴之间的角度（ 如图1所示），可反映AuNR的空间（Z轴）旋转动力学。
   1. 利用极地角的功能.m用双通道差分法²²计算极角（θ）。

5. 数据分析

注:系统可靠的数据分析框架对于 SPT 分析方法的性能和效率至关重要。使用以 MATLAB 编写的自定义软件（https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/Analysis_parameters）。绘图和分析软件（见 材料表）用于绘制绘图。

1. 分析参数
   1. 使用 csv_data_extract_dis_vel_ss.m 和 csv_data_MSD.m 的脚本，根据 表 1中显示的公式计算动态参数。
      注:这些参数用于分析 AuNR 的动态，由三个部分组成。（1） 轨迹相关参数:位移、步数大小、速度、回旋半径（R_g）和转弯角度（T_a）:（2）MSD参数:扩散系数（D_t）和异常扩散指数（α）:和 （3） 旋转相关参数:极角和旋转可操作性（σ）。

措施	定义		物理含义
位移			对象位置的变化
步径大小			两个相邻点之间的距离
速度			对象运动速度
Rg			在特定时间间隔内移动对象的范围
Ta			两个相邻点之间的对象运动方向
Msd			特定时间间隔内物体的平均移动距离
Dt			物体的扩散能力
α			正常扩散（α~1）
极角			对象的 3D 方向信息
Σ			极角数据集的分散程度

表1:用于分析的三种参数类型。 这些参数包括轨迹相关参数（位移、步幅大小、速度、R_g 和 T_a）、MSD参数（MSD、D_t 和α）和旋转相关参数（极角和旋转可操作性）。

2. 轨迹的视觉分析
   注:轨迹可视化可直观地呈现粒子运动的空间多极异质性以及动态参数的轨迹（坐标）分布，如时间映射轨迹、R_g和 D_t映射轨迹以及极角映射轨迹。使用绘图和分析软件绘制了映射轨迹。
   1. 将 x 坐标设置为 X，y 坐标为 Y，时间（R_g、Dt、极角）设置为 Z。
   2. 单击"绘图|散射图|颜色映射绘图"。
   3. 添加颜色条。
3. MSD 分析
   注:粒子的运动活动和运动模式可以通过MSD分析²³获得。D_t越大，粒子的扩散运动就越活跃。当α~1时，粒子会进行正常的扩散运动，否则它们会执行异常的扩散运动。
   1. MSD-τ数字
      1. 将时间间隔（τ）设置为 X，MSD 数据设置为 Y。
      2. 单击"绘图|散射图"
      3. 通过单击"分析|来拟合数据拟合|非线性曲线拟合（功能:等轴测）"。
   2. MSD-τ双对数图
      注:MSD-τ双对数图，其坡度为α截距为D_t，可直观地呈现粒子运动。
      1. 将对数时间间隔设置为 X，对数 MSD 设置为 Y。
      2. 单击"绘图|散射图"。
      3. 通过单击"分析|来拟合数据拟合|线性曲线拟合"。
   3. D-τ图（MSD/4t）
      注:D=MSD/4τ是时间τ和异常因子α函数，D-τ图直接显示扩散系数随时间的变化。当 D 随时间而增加时，α大于 1，粒子会进行超扩散运动。
      1. 将对数时间间隔（τ）设置为 X，对数 D 设置为 Y。
      2. 单击"绘图|散射图"。
      3. 通过单击"分析|来拟合数据拟合|非线性曲线拟合（功能:"等轴测量"）"。
         注:轨迹越短，扩散估计的不准确性就越高。一般来说，通过MSD-τ分析获得D_t 和α，分析间隔时间长（+30 τ）。然而，简单和粗糙的拟合将平滑运动细节。因此，应进行MSD-τ短间隔时间（+lt;10 τ）分析，以在短时间内分析粒子的运动行为。
4. 统计分析
   1. 多粒子统计分析
      注:多粒子统计分析可以反映空间区域粒子的运动状态，间接表示空间异质环境。例如，如果 D_t 的直方图显示大规模分布或多峰分布，则意味着粒子的运动活动是异构的。
      1. 将动态参数（如 D_t、Rg、最大位移）设置为 Y。
      2. 单击"绘图|直方图"。
      3. 双击直方图，并设置除法大小或分区数。单击"应用"。
   2. 单粒子统计分析
      注:单个粒子的统计分析可以显示单个粒子的运动行为，也间接反映周围环境的空间异质性。
      1. 多个帧
         1. 计算单长轨迹所有帧的动态参数（如 T_a、步数大小、极角），并复制到"起源"表，并设置为 Y。
         2. 单击"绘图|直方图"。
         3. 双击直方图，并设置除法大小或分区数。单击"应用"。
            注意:如果 T_a 和步径大小都显示小值分布，则粒子会进行小步超扩散运动。
      2. 移动窗口
         1. 通过移动窗口方法（11帧）计算单长轨迹所有帧的动态参数（如R_g、Dt），并复制到"起源"表，并设置为Y。
         2. 单击"绘图|直方图"。
         3. 双击直方图，并设置除法大小或分区数。单击"应用"。
5. 时间系列分析
   注:统计分析可以揭示NPs的运动状态，时间系列分析可以作为补充来呈现运动行为。结合多个时间系列参数，可以区分 NP 在时间和空间级别的运动行为。
   1. 将时间设置为 X，时间系列参数为 Y（如位移、极角和 R_g）。
   2. 单击"绘图|多窗格图|堆叠绘图|行+符号"。

结果

在协议中，使用了未经修改的 40 x 85 nm CTAB-AuNR。如图2B所示，其纵向质离子最大值为 650 nm（红色区域），横向共振为 520 nm（绿色区域）。以往的文献显示，质子AuNR的光学特性（如LSPR强度）将发生显著变化，其直径为^20，22。在图2C中，U87细胞膜上CTAB-AuNR的散射强度显示了典型的高斯分布，宽度狭窄，与玻璃?...

讨论

所展示的协议用于研究细胞膜上的AuNR的动态。该协议由四个部分组成，包括微观成像、数据提取、动态参数计算和数据分析方法，每个部分都是灵活和通用的。因此，未来有许多可能的应用，例如，研究膜上NP相关膜分子的运动、NP标记受体的内分泌动力学、细胞内NP和囊泡涂层的NPs沿着微管运输的动态分析等。

基本步骤是使用DFM来映像细胞膜上的AuNR运动。目前，已开发出多...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs)	Nanoseedz	NR-40-650	85 nm * 40 nm
Color CMOS camera	Olympus	DP74	Japan
Coverslips	Citoglas	z10212222C	22*22 mm
Dark-field microscopy	Nikon	80i	upright microscope
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141
Fiji	National Institutes of Health	2.0.0-rc-69/1.52 p	a distribution of ImageJ
Grooved glass slide	Sail brand	7103	Single concave
Image J	National Institutes of Health	1.52 j
MATLAB	MathWorks	R2019b
MATLAB Code			https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020
Minimum essential medium (MEM)	Gibco	10-010-CVR	with phenol red
Minimum essential medium (MEM)	Gibco	51200038	no phenol red
Origin	OriginLab	Origin Pro 2018C
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
Plastic cell culture dishes	Falcon	353002
Plastic cell culture dishes	Falcon	353001	35*10 mm
U87 MG cell	American Type Culture Collection	ATCC HTB-14	a human primary glioblastoma cell line