Tek Nanopartikül Darkfield Mikroskopisi Kullanarak Hücre Zarında Altın Nanorodların Difüzyonel Dinamiklerini Görselleştirme

Özet

Burada, hücre zarındaki altın nanorodların (AuNR) dinamiklerini izlemek için geleneksel karanlık alan mikroskopisinin kullanımını gösteriyoruz. Tek AuNR'lerin konumu ve yönü ImageJ ve MATLAB kullanılarak algılanır ve AuNR'lerin difüzif durumları tek parçacık izleme analizi ile karakterize edilir.

Özet

Hücre zarı üzerindeki nanopartiküllerin difüzyonel dinamiklerinin analiz etmek, hücresel alım sürecinin daha iyi anlaşılmasında önemli bir rol oynar ve nano-tıp teslimatının rasyonel tasarımı için teorik bir temel sağlar. Tek parçacık izleme (SPT) analizi, hücre zarı üzerindeki bireysel nanopartiküllerin konumunu ve yönünü araştırabilir ve çevirisel ve dönme durumlarını ortaya getirebilir. Burada, canlı hücre zarında altın nanorodların (AuNR) dinamiklerini izlemek için geleneksel karanlık alan mikroskopisinin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Ayrıca ImageJ ve MATLAB kullanarak AuNR'lerin konumunun ve yönünün nasıl çıkarılacağını ve AuNR'lerin difüzör durumlarının nasıl karakterize edeceğini gösteriyoruz. Yüzlerce parçacığın istatistiksel analizi, tek AuNR'lerin U87 MG hücre zarının yüzeyinde Brownian hareketi gerçekleştirdiğini göstermektedir. Bununla birlikte, bireysel uzun yörünge analizi, AuNR'ların membran üzerinde iki belirgin şekilde farklı hareket durumlarının olduğunu göstermektedir, yani uzun menzilli taşıma ve sınırlı alan hapsi. SPT yöntemlerimiz potansiyel olarak farklı biyolojik hücrelerdeki yüzey veya hücre içi parçacık difüzyonunu incelemek için kullanılabilir ve karmaşık hücresel mekanizmaların araştırılması için güçlü bir araç haline gelebilir.

Giriş

Membran üzerindeki nanopartiküllerin (NP) dinamikleri, hücre fonksiyonlarının, viral veya bakteriyel enfeksiyonların anlaşılması ve yapay nanomedikal iletim sistemlerinin geliştirilmesi için gerekli olan hücresel alım süreci ile yakından ilişkilidir^1,2. Tek parçacık izleme (SPT) tekniği, NPs^3,4'ünheterojen davranışlarını karakterize etmek için sağlam bir araçtır. Genel olarak, hücre zarı akışkandır, bu da proteinler ve lipitler gibi bileşenlerin plazma membran düzleminde yanal olarak hareket edebileceği anlamına gelir^5,6,7. Membran organizasyonu ve yapısının mekansal karmaşıklığı, NP'ler ve membran arasındaki etkileşimin mekansal heterojenliğine yol açabilir. Bu nedenle, NP'lerin membran üzerindeki hareketinin doğrudan görselleştirilmesi hem yüksek uzamsal hem de zamansal çözünürlük gerektirir.

Canlı hücrelerdeki tek tek parçacıkların lokalizasyonunu onlarca nanometre uzamsal çözünürlük ve milisaniyelik bir zaman çözünürlüğü ile izleyen tek parçacık izleme mikroskopisi, NP'leri veya membran molekülleri dinamiklerini incelemek için iyi geliştirilmiştir^8,9. Floresan bazlı mikroskobik görüntüleme teknikleri canlı hücre ortamında NP/molekülleri gözlemlemek için değerli araçlar haline gelmiştir^9,10,11,12. Örneğin, numunenin ince katmanlarını (~100 nm) yüksek patiotemporal çözünürlüğe sahip substrat/çözelti arayüzünde gösteren toplam iç yansıma floresan mikroskopisi, membran molekülleri dinamikleri^13,14çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, düşük yoğunluklu ve hızlı geri dönüşü olmayan fotobleaching gibi tek floroforların doğal dezavantajları izleme doğruluğunu ve süresini azaltır¹³. Bu nedenle, floresan probların yerini alan floresan olmayan plazmonik NP'ler, benzersiz optik özellikleri nedeniyle uzun süreli görüntüleme çalışmalarında giderek daha fazla dikkat çekmiştir¹⁵. Plazmonik NP problarının saçılma sinyallerine dayanarak, karanlık alan mikroskopisi (DFM)^16,interferometrik saçılma (iSCAT) mikroskopisi 17 ve diferansiyel girişim kontrastı mikroskopisi^{(DICM) 18} gibi biyolojik süreçlerin mekanizmasını incelemek için çeşitli optik mikroskobik görüntüleme teknolojileri kullanılmıştır. Ek olarak, AuNR'ların hareket ve dönme dinamiği DFM ve DICM^{18 , 19,20,21,22}kullanılarak elde edilebilir. Tipik olarak, bir SPT deneyinde, nesnenin hareketi optik mikroskop tarafından kaydedilir ve daha sonra SPT analiz yöntemleri ile analiz edilir³. Bireysel NP'ler tarafından oluşturulan zaman çözümlenmiş yörüngeler ve oryantasyonsal açılar normalde stokastik ve heterojendir, bu nedenle çeşitli analiz yöntemleriyle bol dinamik bilgi sunmak gerekir.

Burada, DFM kullanarak Hücre zarı üzerindeki AuNR'lerin dinamiklerini izleyen, ImageJ ve MATLAB ile AuNR'lerin konumunu ve yönünü çıkaran ve AuNR'lerin difüzyonunu SPT analiz yöntemleriyle karakterize eden entegre bir protokol sunuyoruz. Bir gösteri olarak, U87 MG hücre zarında değiştirilmemiş AuNR'lerin (Cetyltrimethylammonium amonyum bromür molekülü tarafından koruyucu ajan olarak sentezlenen CTAB-AuNRs) dinamiklerini görselleştirmek için SPT protokolünün nasıl kullanılacağını burada gösteriyoruz. CTAB-AuNR'lerin biyolojik ortamda proteinleri adsorbe edebileceği, hücre zarı üzerinde hareket edebileceği ve daha sonra 2^,20^,22hücrelerine girebileceği gösterilmiştir. U87 MG hücre merkezi sinir sisteminin en sık görülen ve en kötü huylu tümörüdür ve membran reseptörleri anormal bir şekilde ifade edilir. Membran reseptörleri, AuNR'lerin dinamiklerini etkileyen AuNR'lerdeki proteinlerle etkileşime girebilir. Protokolümüz genellikle biyoloji alanındaki diğer SPT deneyleri için geçerlidir.

Protokol

1. Hücre kültürü

1. Fetal sığır serumu ekleyerek U87 MG hücreleri için komple ortam hazırlayın (son konsantrasyon% 10) ve penisilin-streptomisin (son konsantrasyon %1) minimum temel ortama (MEM). Hücreler alt kültürü için plastik hücre kültürü çanağı kullanın.
2. Pasaj hücreleri haftada 2 ila 3 kez.
   1. Kültür ortamını çıkarın ve hücre tabakasını Dulbecco'nun fosfat tamponlu saliniyle (D-PBS) birleştiğinde 2 ~3 kez durulayın (%80~%90).
   2. Hücre kültürü çanağına 1,0 ila 2,0 mL Trypsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve hücreler yuvarlaklaşana kadar ters bir mikroskop altında hücreleri gözlemleyin (3 ~ 5 dk).
   3. 3.0 mL hazırlanmış tam orta ekleyin ve hücreleri hafifçe pipetleme ile dağıtın.
   4. Taze hücre ortamı (3 mL) ile yeni kültür yemeğine hücre süspansiyonu (1 mL) ekleyin ve hücreleri yeniden biriktirin.
3. Hücreleri nemli bir atmosferde 37 °C ve_%5 CO 2'de sakla.

2. Mikroskop slayt hazırlığı

NOT: SPT deneylerinde üçüncü ila onuncu nesil U87 MG hücreleri yüksek aktivite ile kullanılmaktadır.

1. Etanol (%99,9) içine daldırarak Piranha çözeltisi ile önceden temizlenmiş 22 mm × 22 mm kapak örtülerini sterilize edin.
2. Kapak fişini etanol çözeltisinden çıkarmak için forseps kullanın (adım 2.1) ve alev üzerinde etanol yakarak sterilize edin. Tüm etanol yakıldıktan sonra, kapakları 2 mL hücre ortamı (fenol kırmızısı yok) ile doldurulmuş plastik bir hücre kültürü kabına (35 x 10 mm) yerleştirin.
3. Kapakçık üzerindeki 1.2.3 adımından 50 μL hücre süspansiyonu ekleyin ve hücreleri eşit bir şekilde dağıtmak için kabı ileri geri ve sola ve sağa doğru hafifçe itin. Nemli bir atmosfere yerleştirin.
4. Kapak üzerindeki U87 MG hücreleri % 20-% 40 izdiah (~12 h) ulaştığında, yemeğe 20 μL CTAB-AuNR (138 pM) ekleyin ve dağılın. 5 dakika boyunca nemli atmosferde kuluçkaya yaslanın.
5. Piranha çözeltisi ile önceden toplanan yivli cam kaydırağın (Şekil 1) oluğuna 2.4 adımda tabaktan100μL kültür ortamını (fenol kırmızısı yok) ekleyin.
6. Kapak sapını tabaktan çıkar ve mikroskop cam kaydırağının oluğunun üstüne ters çevirin (Şekil 1). Oje ile kapatın, kurumaya bırakın ve SPT deneyleri yapmak için sahneye yerleştirin.

3. Darkfield mikroskopisi ile tek parçacık izleme deneyleri yapmak (Şekil 1).

1. Yağa batırılmış karanlık alan kondenserine (NA 1.43-1.20) bir damla yağ yerleştirin ve kondenserin cam kaydırağa temas etmesini sağlamak için düğmeyi çevirin.
2. Kapak camının üstüne bir damla yağ koyun ve 60x yağ daldırma hedefini (NA 0.7–1.25) yağa dokunmak için odaklama düğmesini çevirin.
3. Işık kaynağını açın ve görüntüleme düzlemini odaklamak için odaklama düğmesini hafifçe çevirin.
   NOT: Görüş alanında arka plan siyah, hücreler parlak ve CTAB-AuNR'ler (en boy oranı~2:1, Şekil 2)küçük renkli (kırmızı, sarı veya yeşil) saçılma noktalarıdır.
4. Renkli bir CMOS kamera ile örnek saçılma ışığını yakalayın. Görüntüleri kaydetmek için TIFF formatını kaydetmek ve dışa vermek için yazılımdaki "Kamera simgesi" ni tıklatın.

4. Veri toplama

1. Tek uzun vadeli yörüngeyi ayıkla
   1. Zaman serisi koyu alan görüntülerini "RGB renk" modundan "8 bit" moduna dönüştürmek için Şekil 3'te açıklandığı gibi çalıştırın. Resim J'de Resim | | yazın 8 bit. Karşıtlığı ayarlamak için Görüntü | | ayarlama Parlaklık | Karşıtlık.
   2. Bir hedef parçacık seçin ve arka planı "Ctrl+X" ile kutulayıp silerek zaman serisi arka planlarını kesin.
   3. "Eklentiler | Parçacık İzleyici Klasik | Parçacık İzleyici".
   4. Yarıçapı 6' ya, Kesmeyi 0' a ve Yüzdelik'i %0,01 olarak ayarlayın.
      NOT: Parçacığı algılamak için Önizleme yardımıyla üç parametrenin üzerinde ayarlayın. Yarıçapın hedeflenen parçacıktan biraz daha büyük ve en küçük parçacıklar arası ayırmadan daha küçük olduğundan emin olun. Yüzdebirlik, aday parçacıklar olan yoğunluk dağılımının alt sınırıdır.
   5. Bağlantı Aralığını 5'e ve Yer Değiştirme'yi 10 olarak ayarlayın.
      NOT: Parçacığı ardışık bitişik çerçeveler arasında bağlamak için yukarıdaki iki parametreyi ayarlayın. Öteleme, bir parçacığın iki sonraki kare arasında hareket edebileceği maksimum pikseldir ve Bağlantı Aralığı, en iyi karşılık gelen eşleşmeyi belirlerken dikkate alınması gereken ardışık kare sayısıdır.
   6. Sonuçları görmek için ParticleTracker Sonuçları penceresini açmak için "Tamam" ı tıklatın.
   7. Oluşturulan yörüngeleri incelemek için "Tüm Yörüngeleri Görselleştir" i tıklatın.
   8. Yazılım tarafından oluşturulan yörünge AuNR'nin hareketli yörüngesiyle eşleşmiyorsa, algılanan parçacıkları farklı bağlantı aralığı ve yüzdebirlik parametrelerle yeniden bağlamak için üstteki "Parçacıkları Yeniden Bağla" menüsünü tıklatın.
   9. Yazılım tarafından oluşturulan yörünge ve AuNR'nin hareketli yörüngesi eşleşiyorsa sonuçları kaydetmek için "Tam Raporu Kaydet" i tıklatın.
      NOT: Resim J ile tek bir uzun vadeli yörünge çıkarma örneği Şekil 4'tegösterilmiştir.
2. Çok yörüngeli ayıklama
   NOT: Fiji ile çok yörüngeli çıkarma örneği Şekil 5'te gösterilmiştir. Birkaç aşama vardır ve her aşama izleme sürecinde bir adım oluşturur. Her adımın sonucu hemen görüntülenir, bu da çıktı tatmin edici olmadığında kullanıcının yeniden ayar ayarlarına geri dönmesini sağlar.
   1. Zaman serisi koyu alan görüntülerini "RGB renk" modundan "8 bit" moduna dönüştürmek için Şekil 3'te açıklandığı gibi çalıştırın. Resim J yolunda "Resim | | yazın 8 bit". Kontrastlarını ayarlamak için "Resim | | ayarlama Parlaklık | Kontrast".
   2. "Eklentiler | İzleme | TrackMate". "İleri" yi tıklatın.
   3. Açılır menüden "LoG dedektörü" nü seçin ve " İleri "yitıklayın.
   4. Dedektör konfigürasyon panelinin parametrelerini ayarlayın. Tahmini blob çapı 10 olarak ayarlayın, Eşiği 0 olarak ayarlayın ve "Alt Piksel Yerelleştirmesi Yap" ı seçin.
   5. İlk nokta filtreleme panelini açmak için "İleri" yi tıklatın.
      NOT: Hedef noktaları daha da optimize etmek için çeşitli parametreler ayarlanabilir. Bu örnekte, başka hiçbir parametre ayarlandı.
   6. "İleri" yi tıklatın ve açılır menüden "HyperStack displayer" ı seçin.
   7. Spot filtreleme panelini açmak için "İleri" yi tıklatın. Kaliteyi 1,88'in, X'i 38,86'nın, Y'yi 56,54'ün üzerine ayarlayın.
   8. "İleri" yi tıklayın ve açılır menüden "Basit LAP izleyici" yi seçin. Üç parametreyi, yani Bağlama maksimum mesafesini = 15, Boşluk kapatma maksimum mesafesini = 15 ve Boşluk kapatma maksimum çerçeve boşluğu = 5'i ayarlayarak basit LAP izleyicisini yapılandırın.
      NOT: Bağlama-maksimum mesafe, bir noktanın iki kare arasındaki maksimum yer değiştirmesidir. Boşluk kapatma maksimum mesafesi, iki segmentin maksimum deplasmanıdır. Boşluk kapatan maksimum çerçeve boşluğu, köprülenecek iki nokta arasındaki en büyük çerçevedir.
   9. İzlemek için "İleri" yi tıklatın. İşiniz bittiğinde, "İleri" yi tıklatmaya devam edin.
   10. Parçalarda filtreler ayarlayın, örneğin 300'ün üzerindeki parçadaki nokta sayısını ayarlayın.
   11. Son kaydetme paneli açılana kadar "İleri" yi tıklatarak devam edin. Açılan menüden "Parçaları XML dosyasına aktar" ı seçin ve csv biçiminde kaydetmek için " Yürüt "ütıklatın.
3. R/G değerleri
   NOT: R ve G kanallarında hedeflenen AuNR'lerin saçılma yoğunlukları MATLAB (https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/RGandPolarangle) ile yazılmış bir kod kullanılarak renkli koyu alan görüntülerinden elde edilir ve ekstraksiyon prensibi Şekil 6'dasunulmuştur.
   1. X-y koordinatı (ImageJ/Fiji tarafından ayıklanır) göre her karede AuNR'nin orta piksel koordinatını bulmak için xycoordination.m işlevini kullanın.
   2. RGextraction işlevini kullanın.m 3 x 3 piksel matrisi sınırlandırmak, R veya G kanallarının 9 saçılma yoğunluklu değerlerini ayıklamak ve ortalama bir değer hesaplamak için (μ, R veya G olarak tanımlanır).
      NOT: 3 x 3 piksel matrisi, 4.3.1 adımından elde edilen piksel koordinatları üzerinde ortalanır.
4. Kutup açısı
   NOT: Kutup açısı, AuNR'nin boylamı ile AuNR'nin uzamsal (Z ekseni) dönme dinamiklerini yansıtabilen optik eksen (Şekil 1'degösterildiği gibi) arasındaki açıdır.
   1. Polarangle.m işlevini kullanarak kutup açılarını (φ) çift kanallı diferansiyel yöntemiyle hesaplamak^{için 22}, .

5. Veri analizi

NOT: SPT analiz yöntemlerinin performansı ve verimliliği için sistematik ve sağlam bir veri analizi çerçevesi gereklidir. MATLAB ile yazılmış özel yazılım kullanılır (https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020/tree/master/Analysis_parameters). Çizimleri çizmek için bir grafik ve analiz yazılımı (bkz. Malzeme Tablosu)kullanılır.

1. Analiz parametreleri
   1. Dinamik parametreleri Tablo 1'degösterilen formüllere göre hesaplamak için csv_data_extract_dis_vel_ss.m ve csv_data_MSD.m komut dosyalarını kullanın.
      NOT: Bu parametreler AuNR'lerin dinamiklerini analiz etmek için kullanılır ve üç bölümden oluşur. (1) Yörünge ile ilgili parametreler: yer değiştirme, adım boyutu, hız, gyrasyon yarıçapı (R_g)ve dönüş açısı (T_a); (2) MSD parametreleri: difüzyon katsayısı (D_t)ve anormal difüzyon üssü (α); ve (3) Döndürme ile ilgili parametreler: kutup açısı ve dönme yeteneği (σ).

Önlem -ler	Tanımı		Fiziksel anlam
Deplasman			Nesnelerin konumundaki değişiklikler
Adım boyutu			bitişik iki nokta arasındaki mesafe
Hız			Nesnelerin hareket hızı
Rg			Nesnelerin aralığını belirli bir zaman aralığında taşıma
Ta			nesnelerin iki bitişik nokta arasındaki hareket yönü
Msd			Belirli bir zaman aralığındaki nesnelerin ortalama hareket mesafesi
Dt			Nesnelerin difüzyon yeteneği
Α			Normal difüzyon (α~1)
Kutup açısı			Nesnelerin 3D yönlendirme bilgileri
Σ			Kutup açısı veri kümesinin dağılım derecesi

Tablo 1: Analiz için kullanılan üç tür parametre. Bunlar arasında yörünge ile ilgili parametreler (yer değiştirme, adım boyutu, hız, R_g ve T_a),MSD parametreleri (MSD, D_t ve α) ve döndürme ile ilgili parametreler (kutup açısı ve dönme kabiliyeti) saydır.

2. Yörüngenin görsel analizi
   NOT: Yörünge görselleştirme, parçacık hareketinin mekansal heterojenliğini ve zaman haritalama yörüngesi, R_g- ve D_t-haritalama yörüngesi ve kutup açısı haritalama yörüngesi gibi dinamik parametrelerin yörünge (koordinat) dağılımını sezgisel olarak sunabilir. Haritalama yörüngeleri grafik ve analiz yazılımı kullanılarak çizilmiştir.
   1. x koordinatı X, y koordinatı Y ve zaman (R_g, D_t, kutup açısı) Z olarak ayarlayın.
   2. Tıklayın "Çizim | Saçılma arsa | Renk eşleme Çizimi".
   3. Renk çubuğunu ekleyin.
3. MSD analizi
   NOT: Parçacıkların hareket aktivitesi ve hareket modu MSD analizi ile elde edilebilir²³. D_tne kadar büyükse, parçacıkların difüzyon hareketi o kadar aktif olur. α ~ 1 olduğunda, parçacıklar normal difüzyon hareketi yaparlar, aksi takdirde anormal difüzyon hareketi gerçekleştirirler.
   1. MSD-ν rakamları
      1. Zaman aralığını (φ) X, MSD verilerini Y olarak ayarlayın.
      2. Tıklayın "Çizim | Saçılma arsası"
      3. "Analiz | Uygun | Doğrusal olmayan eğri montajı (fonksiyon: alometrik)".
   2. MSD-ν çift logaritmik şekil
      NOT: Eğimi α ve kesişimi D_tolan MSD-ν çift logaritmik figür, sezgisel olarak parçacık hareketi sunabilir.
      1. Logaritmik zaman aralığını X, logaritmik MSD'yi Y olarak ayarlayın.
      2. Tıklayın "Çizim | Saçılma arsa".
      3. "Analiz | Uygun | Doğrusal eğri uydurma".
   3. D-ν rakamı (MSD/4t)
      NOT: D=MSD/4τ, α zaman ve anomali faktörünün bir fonksiyonudur ve D-ν şekli doğrudan difüzyon katsayısının zamanla değişimini gösterir. D zamanla arttığında, α 1'den büyüktür ve parçacıklar süper difüzyon hareketi yapar.
      1. Logaritmik zaman aralığını (δ) X, logaritmik D'yi Y olarak ayarlayın.
      2. Tıklayın "Çizim | Saçılma arsa".
      3. "Analiz | Uygun | Doğrusal olmayan eğri montajı (İşlev: "Allometrik")".
         NOT: Yörüngeler ne kadar kısa olursa, difüzyon tahminlerinin yanlışlığı o kadar yüksek olur. Genel olarak, uzun aralık süresinin MSD-ν analizi yoluyla D_t ve α elde edildi (> 30 φ). Ancak, basit ve kaba montaj hareket ayrıntılarını yumuşatacaktır. Bu nedenle, parçacıkların hareket davranışını kısa sürede analiz etmek için kısa aralık süresinin (< 10 δ) MSD-ν analizi yapılmalıdır.
4. İstatistiksel analiz
   1. Çok parçacıklı istatistiksel analiz
      NOT: Çok parçacıklı istatistiksel analiz, uzamsal bir bölgedeki parçacıkların hareket durumunu yansıtabilir ve bu da dolaylı olarak mekansal heterojenlik ortamını gösterir. Örneğin, D_t histogramı büyük ölçekli bir dağılım veya çok tepeli bir dağılım sergiliyorsa, parçacıkların hareket aktivitelerinin heterojen olduğu anlamına gelir.
      1. Dinamik parametreleri (D_t, R_g, maksimum yer değiştirme gibi) Y olarak ayarlayın.
      2. Tıklayın "Çizim | Histogram".
      3. Histogramı çift tıklatın ve bölme boyutunu veya bölüm sayısını ayarlayın. "Uygula" yı tıklatın.
   2. Tek parçacıklı istatistiksel analiz
      NOT: Tek parçacıkların istatistiksel analizi, çevrenin mekanotemporal heterojenliğini de dolaylı olarak yansıtan bireysel parçacıkların hareket davranışını gösterebilir.
      1. Birden çok kare
         1. Tek bir uzun yörüngenin tüm karelerinin dinamik parametrelerini (T_a, adım boyutu, kutup açısı gibi) hesaplayın ve Origin tablosuna kopyalayıp Y olarak ayarlayın.
         2. Tıklayın "Çizim | Histogram".
         3. Histogramı çift tıklatın ve bölme boyutunu veya bölüm sayısını ayarlayın. "Uygula" yı tıklatın.
            NOT: Hem T_a hem de adım boyutu küçük bir değer dağılımı sergiliyorsa, parçacıklar küçük adımlı bir süper difüzyon hareketi yapar.
      2. Pencereleri taşıma
         1. Hareketli pencere yöntemiyle (11 kare) tek uzun yörüngenin tüm karelerinin dinamik parametrelerini (R_g, D_tgibi) hesaplayın ve Origin tablosuna kopyalayıp Y olarak ayarlayın.
         2. Tıklayın "Çizim | Histogram".
         3. Histogramı çift tıklatın ve bölme boyutunu veya bölüm sayısını ayarlayın. "Uygula" yı tıklatın.
5. Zaman serisi analizi
   NOT: İstatistiksel analiz NP'lerin hareket durumunu ortaya alabilir ve zaman serisi analizi hareket davranışını ek olarak sunabilir. Birkaç zaman serisi parametresini birleştirerek, NP'lerin hareket davranışını zamansal ve uzamsal düzeylerde ayırt edebilir.
   1. Zamanı X, zaman serisi parametrelerini Y (yer değiştirme, kutup açısı ve R g gibi) olarak_ayarlayın.
   2. Tıklayın "Çizim | Çok bölmeli diyagram | Yığılmış çizim | Çizgi + Sembol".

Sonuçlar

Protokolde değiştirilmemiş 40 x 85 nm CTAB-AuNR kullanıldı. Şekil 2B'degösterildiği gibi, boyuna plazmonik maksimum değeri ~650 nm 'dir (kırmızı bölge) ve enine rezonansı 520 nm'dedir (yeşil bölge). Önceki literatürler plazmonik AuNR'lerin optik özelliklerinin (LSPR yoğunluğu gibi) çapları^20,22ile önemli ölçüde değişeceğini ortaya koydu. Şekil 2C'de, U87 hücre zarında CTA...

Tartışmalar

Sunulan protokol, AuNR'lerin hücre zarı üzerindeki dinamiklerini incelemek için kullanılır. Mikroskobik görüntüleme, veri çıkarma, dinamik parametre hesaplama ve veri analizi yöntemleri olmak üzere dört bölümden oluşan protokolde her bölüm esnek ve evrenseldir. Bu nedenle, örneğin, NP bağlantılı membran moleküllerinin membran üzerindeki hareketini, NP etiketli reseptörlerin endositoz dinamiklerini, hücre içi NP'lerin dinamik analizini ve mikrotübüller boyunca vezikül kaplı NPs taşımacı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs)	Nanoseedz	NR-40-650	85 nm * 40 nm
Color CMOS camera	Olympus	DP74	Japan
Coverslips	Citoglas	z10212222C	22*22 mm
Dark-field microscopy	Nikon	80i	upright microscope
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141
Fiji	National Institutes of Health	2.0.0-rc-69/1.52 p	a distribution of ImageJ
Grooved glass slide	Sail brand	7103	Single concave
Image J	National Institutes of Health	1.52 j
MATLAB	MathWorks	R2019b
MATLAB Code			https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020
Minimum essential medium (MEM)	Gibco	10-010-CVR	with phenol red
Minimum essential medium (MEM)	Gibco	51200038	no phenol red
Origin	OriginLab	Origin Pro 2018C
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
Plastic cell culture dishes	Falcon	353002
Plastic cell culture dishes	Falcon	353001	35*10 mm
U87 MG cell	American Type Culture Collection	ATCC HTB-14	a human primary glioblastoma cell line