OP-IVM:将卵母细胞取回后的体外成熟与妇科手术相结合

摘要

妇科手术前体外成熟（IVM）（OP-IVM）将卵母细胞取回后的IVM与常规妇科手术相结合，并作为常规IVM应用的延伸，用于保留生育能力。

摘要

妇科手术前体外成熟（IVM）的使用（OP-IVM）是传统IVM的延伸，它将卵母细胞取回后的IVM与常规妇科手术相结合。OP-IVM适用于接受良性妇科手术的患者，他们需要保留生育能力（FP）或不孕症治疗，如体外受精和胚胎移植（IVF-ET）。在手术室中，接受良性妇科手术的患者首先被麻醉并接受超声引导的未成熟卵泡抽吸（IMFA）治疗。随着随后的妇科手术的进行，检查积云 - 卵母细胞复合物（COCs），并将未成熟的COCs转移到IVM培养基中并在IVF实验室中培养28-32小时。评估后，将选择MII阶段的成熟卵母细胞并将其冷冻保存在液氮中用于FP或通过卵胞浆内单精子注射（ICSI）受精用于IVF-ET。通过将IVM与妇科手术相结合，可以保存本来会丢弃的未成熟卵母细胞并将其用于辅助生殖技术（ART）。本文介绍了OP-IVM的程序，重要性和关键方面。

引言

IVM是一种ART，其中人未成熟的卵母细胞在体外培养至IVF-ET或FP成熟。在IVM中，不使用排卵诱导药物，从而减轻疼痛，经济负担和并发症，如卵巢过度刺激综合征（OHSS）1，2。此外，IVM特别适用于癌症患者的FP和不孕症患者的不孕症治疗，他们可能无法或没有时间接受排卵诱导治疗^3。因此，虽然取回的卵母细胞数量、临床妊娠率（CPR）和活产率（LBR）均低于IVF^4、5，但IVM有其独特的优势。

患有子宫内膜病变、输卵管积水或卵巢囊肿的不孕患者通常在 ART 治疗前进行妇科手术，其卵母细胞通常不成熟。OP-IVM使用引导经阴道超声来检索未成熟的卵母细胞并在体外生长，直到IVF-ET或FP成熟。OP-IVM在卵母细胞取回和妇科手术后结合IVM，从而减少受控卵巢过度刺激周期中常见的并发症，节省时间和金钱。对于有生育能力的患者，OP-IVM可以作为接受常规妇科手术的"生育保险"。

此外，妇科手术造成的损害，如电烙^术6，7和卵巢肿瘤切除术，可以通过妇科手术前的卵母细胞取回来减少。因此，与常规妇科手术相比，OP-IVM可以减少不孕症治疗期间的手术次数，防止卵巢手术期间功能性卵母细胞的丧失。

先前的一项研究表明，额外的卵母细胞取回程序既不会增加手术并发症和不良妊娠结局，也不会延长住院时间⁸。一些患者通过OP-IVM⁸进行了活产，这表明这种方法的可行性。本文描述了可能受益于OP-IVM的患者的特征以及OP-IVM的程序和关键点，并讨论了人类卵母细胞成熟的评估。

研究方案

注:与OP-IVM方法相关的研究已获得北京大学第三医院机构审查委员会（IRB）和北京大学伦理委员会的批准（2014S2004）。OP-IVM的摘要如图 1所示。分步过程将在下一节中介绍。

1. 向合适的患者介绍OP-IVM

1. 确定可能受益于OP-IVM的潜在患者，例如步骤1.1.1-1.1.3中描述的患者:
   1. 多囊卵巢综合征 （PCOS） 有克罗米芬耐药的患者，需要腹腔镜卵巢钻孔手术。
   2. 在 ART 治疗前，需要良性妇科手术的不孕患者，如宫腔镜肌瘤切除术、息肉切除术、经宫颈切除术和腹腔镜输卵管手术以及卵巢切除术。
   3. 正在接受放化疗或放疗的癌症或血液系统疾病患者。

2. 知情同意

1. 向患者提供完整的信息，包括为什么OP-IVM可能有益，其程序，IVM卵母细胞的使用（IVF-ET或冷冻保存），估计的CPR和LBR以及可能的并发症。要求患者通过签署同意书给予知情同意。

3. 准备标签和IVM卵母细胞培养基

1. 打印带有患者姓名和日期的识别（ID）标签，用于培养皿和试管。
2. 向4孔板的每个孔中加入0.5 mL补充有0.075 IU / mL卵泡刺激素（FSH）和0.075 IU / mL黄体生成素（LH）的IVM培养基。用油盖住介质。
   注意:在层流清洁工作台上执行所有这些程序。
3. 使用前至少6小时，在含有5%CO₂和5%O 2的加湿空气中，在37°C下用IVM卵母细胞培养基预热4孔板。

4. 在手术室进行麻醉

1. 在进行麻醉之前检查患者的姓名。
2. 通过麻醉师静脉麻醉患者。

5. 进行卵母细胞检索

1. 在培养皿和管子上标记标签上的姓名，日期和ID。
2. 将患者置于膀胱切石术位置;不断消毒，悬垂，并用温盐水擦洗阴道。
3. 将超声波探头放在阴道内;扫描并记录两个卵巢中的卵泡数量。找到离卵巢最近的位置作为穿刺部位，避开肠道、膀胱和大血管。
4. 抽吸滤泡液。
   1. 穿刺前用pH稳定的处理介质清洗针头（见 材料表）。
   2. 在超声引导下将19G单腔抽吸针注射到卵巢中。
   3. 刺穿距离探针边界最远的较大卵泡。在低位，快速注入补充25 U / mL肝素的冲洗溶液。在80-90 mmHg的压力下用针头吸出滤泡液，稍微旋转针头以吸出尽可能多的滤泡液。在这个平面上从近到远侧刺穿其他卵泡。
      注意:在抽吸过程中，含有卵母细胞的卵泡液将在负压入无菌的 10 mL 试管。肝素可以降低滤泡液的粘度，以促进抽吸过程。
   4. 从卵巢中取出针头（将针头保持在阴道壁内）。调整超声探头的方向，并刺穿其他平面上剩余的卵泡。尝试抽吸直径约为5-9毫米的所有卵泡。
      注意:调整探针的位置，使其始终最接近卵巢。用适当的力按压阴道穹窿，以减少损伤和出血。
   5. 在一个卵巢中完成后拔出针头，用处理介质清洗针头，然后使用相同的方法刺穿另一侧。
      注意:25-30分钟内完全吸入卵泡。
5. 在确认患者的姓名和身份后几分钟内将卵泡液从手术室转移到IVF实验室。
   注意:尽快将吸入的滤泡液转移到IVF实验室工作台，以防止凝血。
6. 穿刺所有卵泡后，用B型超声检测盆腔中的活动性出血。插入窥器，并将尖端指向后穹窿，以检测穿刺部位的活动性出血。
   注意:如果卵巢位置正常并且仔细进行卵母细胞取回，则不应在阴道穿刺部位观察到活动性出血。对于即使在按压后仍持续的轻度出血，请在阴道内保持无菌纱布敷压2-4小时。使用带有血管钳子的钳子控制小动脉出血过多2-4小时。盆腔或卵巢出血很少发生，应通过腹腔镜手术进行电凝控制。

6. 妇科手术

1. 根据患者的需要和状况，在卵母细胞取出后进行适当的妇科手术。
   1. 对具有克罗米芬耐药性的多囊卵巢综合征 （PCOS） 患者进行腹腔镜卵巢钻孔手术。
   2. 在ART治疗前对不孕不育患者进行良性妇科手术，如宫腔镜子宫肌瘤切除术，息肉切除术，经宫颈切除术和腹腔镜输卵管手术以及卵巢囊肿切除术。
   3. 对需要接受放化疗的癌症或血液病患者进行生育冷冻保存的卵巢切除术。
      注意:这些妇科手术是基本和标准化的临床操作。各国和医院的操作指南应相对相似。

7. 执行 IVM

注意:在37°C的同温平地上执行IVM的整个过程。

1. 用70μm尼龙细胞过滤器过滤吸入的卵泡液。用预热的pH稳定处理介质反复冲洗培养管和过滤器。确保将所有未成熟的COC完全转移到培养皿中。收集过滤后的液体，冲洗，并在100 x 15 mm培养皿中培养。
2. 在立体镜下以40倍放大倍率检查COC（图2）。将未成熟物快速转移到预热的IVM卵母细胞培养基中。
   注:根据操作员的习惯选择适当的放大倍率。
3. 记录培养的未成熟COC的数量。
4. 告知患者培养的 COC 的数量。与患者及其伴侣讨论精液的收集。按照正常程序进行精子提取。
5. 将未成熟的COCs在含有5%CO 2和5%O 2的加湿空气中37°C培养28-32小时。
6. 评估卵母细胞成熟度。
   1. 通过在立体镜下使用玻璃巴斯德移液器以40倍放大倍率重复移液来去除积云细胞。检查极体（PB）的挤出以确定卵母细胞的发育阶段。参见 图2， 了解COCs，中期II（MII），中期I（MI）和具有明显形态特征的生发囊泡（GV）中卵母细胞的代表性图像。
      注意:使用垂直火焰（例如，本生燃烧器）将玻璃巴斯德移液器的直径调整为卵母细胞的大小。
   2. 计数MII卵母细胞并记录数字。
   3. 选择成熟的卵母细胞进行IVF或玻璃化。
      注意:在卵母细胞成熟当天收集精子进行IVF，但不收集卵母细胞玻璃化。
   4. 在具有积云细胞的原始IVM培养基中，在GV和MI阶段培养未成熟的卵母细胞再培养10-14小时。重复步骤 7.6.2-7.6.3。

8. 进行 ICSI 或卵母细胞玻璃化

1. 遵循生殖中心^{的标准程序8。}

9. 培养胚胎并进行胚胎冷冻保存

1. 遵循生殖中心^{的标准程序8。}

结果

截至2019年12月，OP-IVM用于274名患者的生育能力保存。2014年至2016年间158名患者的胚胎学和生殖结局发表在之前的论文⁸中。以下示例讨论了2016年接受OP-IVM的PCOS患者所遵循的程序。患者为28岁，被诊断为原发性不孕、左附件囊肿和PCOS。她于2016年9月28^日接受了腹腔镜膀胱切除术和OP-IVM手术。获得27个未成熟的COC。培养28小时后，选取7个MII阶段的卵母细...

讨论

本文中描述的OP-IVM方法扩展到传统的IVM应用，并将卵母细胞取回后的IVM与常规妇科手术相结合。在妇科手术中会丢失的卵母细胞现在可用于IVF-ET或FP，而无需额外的手术风险。OP-IVM首先用于在PCOS患者卵巢钻孔之前取回卵母细胞。其应用很快扩展到需要良性妇科手术的不孕患者和需要放化疗的癌症或血液疾病患者。由于存在潜在的转移风险，OP-IVM不适合或推荐用于恶性肿瘤患者。基于OP-IVM，该机构?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
19 G single-lumen aspiration needles	Cook, Australia	K-OPS-7035-REH-ET
4-well plate	Corning
70 μm nylon cell strainer	Falcon, USA	352350
CO2 Incubator	Thermo
Culture oil	Vitrolife, Sweden	10029,OVOIL	Step 3.2.
FSH & LH	Ferring Reproductive Health, Germany	MENOPUR®
Glass Pasteur pipette	Hilgenberg GmbH, Germany	3154102-26
G-MOPS medium			pH-stable handling medium for washing the needle before puncturing
IVM medium	Origio, Denmark	ART-1600-B
Laminar Flow Clean Benches	ESCO
Petri dish	Thermo Fisher Scientific, Denmark	263991
pH stable handing media designed to support the handling and manipulation of oocytes and embryos outside the incubator	Vitrolife, Sweden	10130, G-MOPS PLUS	Step 7.1.
Rinse solution	Cook, Australia	K-SIFB-100
Stereoscope	Nikon