OP-IVM: Kombination der In-vitro-Reifung nach Eizellentnahme mit gynäkologischer Chirurgie

Zusammenfassung

Die In-vitro-Reifung (IVM) vor der gynäkologischen Operation (OP-IVM) kombiniert IVM nach Eizellentnahme mit routinemäßiger gynäkologischer Chirurgie und dient als Erweiterung herkömmlicher IVM-Anwendungen zur Fertilitätserhaltung.

Zusammenfassung

Die Anwendung der In-vitro-Reifung (IVM) vor der gynäkologischen Operation (OP-IVM) ist eine Erweiterung der konventionellen IVM, die IVM nach Eizellentnahme mit routinemäßigen gynäkologischen Operationen kombiniert. OP-IVM eignet sich für Patienten, die sich einer gutartigen gynäkologischen Operation unterziehen und die Fruchtbarkeitserhaltung (FP) oder Unfruchtbarkeitsbehandlungen wie In-vitro-Fertilisation und Embryotransfer (IVF-ET) benötigen. Im Operationssaal werden Patienten, die sich einer gutartigen gynäkologischen Operation unterziehen, zunächst betäubt und erhalten eine ultraschallgeführte Behandlung mit unreifer Follikelaspiration (IMFA). Während der anschließenden gynäkologischen Operation werden die Kumulus-Eizell-Komplexe (COCs) untersucht und die unreifen COCs in das IVM-Medium übertragen und für 28-32 Stunden im IVF-Labor kultiviert. Nach der Beurteilung werden reife Eizellen im MII-Stadium ausgewählt und in flüssigem Stickstoff für FP kryokonserviert oder durch intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) für IVF-ET befruchtet. Durch die Kombination von IVM mit gynäkologischer Chirurgie können unreife Eizellen, die verworfen worden wären, gerettet und für die assistierte Reproduktionstechnologie (ART) verwendet werden. Das Verfahren, die Bedeutung und die kritischen Aspekte von OP-IVM werden in diesem Artikel beschrieben.

Einleitung

IVM ist eine ART, bei der menschliche unreife Eizellen in vitro kultiviert werden, um für IVF-ET oder FP zu reifen. Bei IVM werden keine Ovulationsinduktionsmedikamente verwendet, wodurch Schmerzen, finanzielle Belastungen und Komplikationen wie das ovarielle Überstimulationssyndrom (OHSS)^1,2reduziert werden. Darüber hinaus eignet sich IVM besonders für die FP von Krebspatienten und die Unfruchtbarkeitsbehandlung von hormonsensitiven Patientinnen, die möglicherweise nicht in der Lage sind oder keine Zeit haben, eine Ovulationsinduktionstherapie zu erhalten³. Obwohl die Anzahl der entnommenen Eizellen, die klinische Schwangerschaftsrate (CPR) und die Lebendgeburtenrate (LBR) niedriger sind als die von IVF^4,5,hat IVM seine eigenen einzigartigen Vorteile.

Unfruchtbare Patienten mit Endometriumläsionen, Hydrosalpinx oder Ovarialzysten haben in der Regel vor der ART-Behandlung eine gynäkologische Operation, und ihre Eizellen sind normalerweise unreif. OP-IVM verwendet geführten transvaginalen Ultraschall, um die unreifen Eizellen zu entnehmen und sie in vitro bis zur Reifung für IVF-ET oder FP zu züchten. OP-IVM kombiniert IVM nach der Eizellentnahme und gynäkologischen Operation, wodurch Komplikationen, die in kontrollierten Ovarialüberstimulationszyklen üblich sind, reduziert und Zeit und Geld gespart werden. Für fruchtbare Patienten könnte OP-IVM als "Fruchtbarkeitsversicherung" dienen, während sie sich einer routinemäßigen gynäkologischen Operation unterziehen.

Darüber hinaus könnten Schäden, die durch gynäkologische Operationen wie Elektrokauter^6,7 und Ovarialtumorresektion verursacht werden, durch Eizellentnahme vor der gynäkologischen Operation reduziert werden. Daher könnte OP-IVM im Vergleich zu routinemäßigen gynäkologischen Operationen die Anzahl der Operationen während der Unfruchtbarkeitsbehandlung reduzieren und den Verlust funktioneller Eizellen während der Ovarialchirurgie verhindern.

Eine frühere Studie hat gezeigt, dass das zusätzliche Verfahren der Eizellentnahme weder chirurgische Komplikationen und nachteilige Schwangerschaftsergebnisse erhöhen noch den Krankenhausaufenthalt verlängern würde⁸. Einige Patienten haben durch OP-IVM⁸eine Lebendgeburt bekommen, was auf die Machbarkeit dieser Methode hinweist. Dieses Papier beschreibt Merkmale von Patienten, die von OP-IVM profitieren können, sowie Verfahren und kritische Punkte von OP-IVM und diskutiert die Bewertung der menschlichen Eizellreife.

Protokoll

HINWEIS: Studien im Zusammenhang mit der OP-IVM-Methode wurden vom Institutional Review Board (IRB) des Dritten Krankenhauses der Universität Peking und der Ethikkommission der Universität Peking (2014S2004) genehmigt. Eine Zusammenfassung von OP-IVM ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Schritt-für-Schritt-Vorgehensweise wird im folgenden Abschnitt vorgestellt.

1. Einführung von OP-IVM bei geeigneten Patienten

1. Identifizieren Sie potenzielle Patienten, die von OP-IVM profitieren könnten, wie in den Schritten 1.1.1-1.1.3 beschrieben:
   1. Patientinnen des polyzystischen Ovarialsyndroms (PCOS) mit Clomifenresistenz, die eine laparoskopische Ovarialbohroperation benötigen.
   2. Unfruchtbare Patienten, die vor der ART-Behandlung gutartige gynäkologische Operationen wie hysteroskopische Myomektomie, Polypektomie, transzervikale Septumresektion und laparoskopische Tubenchirurgie sowie Oophorozystektomie benötigen.
   3. Patienten mit Krebs oder hämatologischen Erkrankungen, die eine Chemoradiotherapie oder Strahlentherapie erhalten.

2. Einwilligung nach Aufklärung

1. Bereitstellung vollständiger Informationen für Patienten, einschließlich der Frage, warum OP-IVM von Vorteil sein kann, seines Verfahrens, der Verwendung von IVM-Eizellen (IVF-ET oder Kryokonservierung), geschätzter CPRs und LBRs und möglicher Komplikationen. Bitten Sie die Patienten, eine Einwilligung nach Aufklärung zu geben, indem Sie die Einverständniserklärung unterschreiben.

3. Etiketten und IVM-Eizellmedium vorbereiten

1. Drucken Sie Identifikationsetiketten (ID) mit dem Namen und den Daten des Patienten für Kulturschalen und Tuben.
2. Fügen Sie 0,5 ml IVM-Medium, ergänzt mit 0,075 I.E./ml follikelstimulierendem Hormon (FSH) und 0,075 I.E./ml luteinisierendem Hormon (LH), zu jeder Vertiefung einer 4-Well-Platte hinzu. Bedecken Sie das Medium mit Öl.
   HINWEIS: Führen Sie alle diese Verfahren in Laminar-Flow-Clean-Bänken durch.
3. Die 4-Well-Platte mit IVM-Eizellmedium bei 37 °C in befeuchteter Luft mit 5%_CO2 und 5% O2 mindestens₆ h vor Gebrauch vorwärmen.

4. Verabreichen Sie eine Anästhesie in einem Operationssaal

1. Überprüfen Sie den Namen des Patienten, bevor Sie eine Anästhesie verabreichen.
2. Intravenöse Anästhesie des Patienten durch Anästhesisten.

5. Eizellentnahme durchführen

1. Markieren Sie die Etiketten mit Name, Datum und ID auf den Kulturschalen und Tuben.
2. Setzen Sie den Patienten in die Blasenlithotomie-Position; Ständig desinfizieren, drapieren und schrubben Sie die Vagina mit warmer Kochsalzlösung.
3. Platzieren Sie die Ultraschallsonde in der Vagina; Scannen und notieren Sie die Anzahl der Follikel in beiden Eierstöcken. Finden Sie den Ort, der dem Eierstock als Einstichstelle am nächsten ist, und vermeiden Sie den Darm, die Blase und die großen Blutgefäße.
4. Aspirieren Sie follikuläre Flüssigkeit.
   1. Waschen Sie die Nadel vor dem Durchstechen mit pH-stabilem Handhabungsmedium(siehe Materialtabelle ).
   2. Injizieren Sie die 19 G, Ein-Lumen-Aspirationsnadel unter Anleitung von Ultraschall in die Eierstöcke.
   3. Punktieren Sie größere Follikel mit klaren Grenzen, die der Sonde am nächsten sind. In einer niedrigen Position die Spüllösung, die mit 25 U / ml Heparin ergänzt wird, schnell injizieren. Aspirieren Sie follikuläre Flüssigkeit mit der Nadel unter einem Druck von 80-90 mmHg und drehen Sie die Nadel leicht, um so viel Follikelflüssigkeit wie möglich abzusaugen. Punktieren Sie andere Follikel von der nahen bis zur anderen Seite auf dieser Ebene.
      HINWEIS: Während der Aspiration fließt follikuläre Flüssigkeit, die Eizellen enthält, unter Unterdruck in ein steriles 10-ml-Reagenzglas. Heparin kann die Viskosität der Follikelflüssigkeit reduzieren, um den Aspirationsprozess zu erleichtern.
   4. Entfernen Sie die Nadel vom Eierstock (halten Sie die Nadel in der Vaginalwand). Stellen Sie die Richtung der Ultraschallsonde ein und punktieren Sie die verbleibenden Follikel auf anderen Ebenen. Versuchen Sie, alle Follikel mit einem Durchmesser von ~ 5-9 mm abzusaugen.
      HINWEIS: Stellen Sie die Position der Sonde ein, um sie jederzeit am nächsten an den Eierstöcken zu halten. Drücken Sie den vaginalen Fornix mit entsprechender Kraft, um Verletzungen und Blutungen zu reduzieren.
   5. Ziehen Sie die Nadel nach dem Beenden in einem Eierstock heraus, waschen Sie die Nadel mit dem Handhabungsmedium und punktieren Sie die andere Seite mit der gleichen Methode.
      HINWEIS: Vollständige Follikelaspiration innerhalb von 25-30 min.
5. Übertragen Sie die Follikelflüssigkeit innerhalb weniger Minuten nach Bestätigung des Namens und der ID des Patienten aus dem Operationssaal in das IVF-Labor.
   HINWEIS: Übertragen Sie aspirierte Follikelflüssigkeit so schnell wie möglich in die IVF-Laborbank, um eine Gerinnung zu verhindern.
6. Erkennen Sie aktive Blutungen in der Beckenhöhle mit B-Mode-Ultraschall nach Punktion aller Follikel. Setzen Sie ein Spekulum ein und richten Sie die Spitze auf den hinteren Fornix, um aktive Blutungen an der Einstichstelle zu erkennen.
   HINWEIS: An der vaginalen Punktionsstelle sollte keine aktive Blutung beobachtet werden, wenn die Eierstockposition normal ist und die Eizellentnahme sorgfältig durchgeführt wird. Für leichte Blutungen, die auch nach der Kompression anhalten, halten Sie eine sterile Mullkompresse in der Vagina für 2-4 h. Kontrollieren Sie übermäßige Blutungen aus kleinen Arterien mit Klammern mit Gefäßzange für 2-4 h. Blutungen in der Beckenhöhle oder im Eierstock, die selten auftreten, sollten durch Elektrokoagulation durch laparoskopische Operation kontrolliert werden.

6. Gynäkologische Chirurgie

1. Führen Sie je nach Bedarf und Zustand des Patienten nach der Eizellentnahme eine geeignete gynäkologische Operation durch.
   1. Führen Sie eine laparoskopische Ovarialbohroperation für Patientinnen mit polyzystischem Ovarialsyndrom (PCOS) mit Clomifenresistenz durch.
   2. Führen Sie vor der ART-Behandlung eine gutartige gynäkologische Operation für unfruchtbare Patienten durch, wie hysteroskopische Myomektomie, Polypektomie, transzervikale Septumresektion und laparoskopische Tubenchirurgie sowie Oophorozystektomie.
   3. Führen Sie eine Ovariektomie zur Kryokonservierung der Fruchtbarkeit von Patienten mit Krebs oder hämatologischen Erkrankungen durch, die eine Chemoradiotherapie benötigen.
      HINWEIS: Diese gynäkologischen Operationen sind grundlegende und standardisierte klinische Operationen. Die Operationsrichtlinien in verschiedenen Ländern und Krankenhäusern sollten relativ ähnlich sein.

7. IVM durchführen

HINWEIS: Führen Sie den gesamten IVM-Prozess auf einer homothermen Ebene mit 37 °C durch.

1. Filtern Sie die angesaugte Follikelflüssigkeit mit einem 70 μm Nylon-Zellsieb. Kulturröhrchen und Sieb wiederholt mit vorgewärmtem pH-stabilem Handhabungsmedium abspülen. Stellen Sie sicher, dass alle unreifen COCs vollständig auf das Kulturgericht übertragen werden. Die gefilterte Flüssigkeit sammeln, ausspülen und in einer 100 x 15 mm großen Petrischale entnehmen.
2. Untersuchen Sie die COCs (Abbildung 2) unter dem Stereoskop mit 40-facher Vergrößerung. Übertragen Sie die Unreifen schnell in ein vorgewärmtes IVM-Eizellmedium.
   HINWEIS: Wählen Sie eine geeignete Vergrößerung in Abhängigkeit von der Gewohnheit des Bedieners.
3. Notieren Sie die Anzahl der kultivierten unreifen COCs.
4. Informieren Sie den Patienten über die Anzahl der kultivierten COCs. Besprechen Sie die Samenentnahme mit den Patienten und ihren Partnern. Führen Sie die Spermienextraktion nach dem normalen Verfahren durch.
5. Kultivieren Sie die unreifen COCs bei 37 °C in befeuchteter Luft mit 5% CO2 und 5%_O2 für 28-32 h.
6. Beurteilen Sie die Reife der Eizelle.
   1. Entleeren Sie die Kumuluszellen durch wiederholtes Pipettieren mit einer Glas-Pasteur-Pipette unter dem Stereoskop mit 40-facher Vergrößerung. Untersuchen Sie die Extrusion des Polkörpers (PB), um das Entwicklungsstadium der Eizellen zu identifizieren. Siehe Abbildung 2 für repräsentative Bilder von Eizellen in COCs, Metaphase II (MII), Metaphase I (MI) und Keimbläschen (GVs) mit klaren morphologischen Merkmalen.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine vertikale Flamme (z. B. eines Bunsenbrenners), um den Durchmesser der Pasteurpipette aus Glas auf die Größe einer Eizelle einzustellen.
   2. Zählen Sie MII-Eizellen und notieren Sie die Anzahl.
   3. Wählen Sie reife Eizellen für IVF oder Vitrifikation.
      HINWEIS: Sammeln Sie Spermien an dem Tag, an dem die Eizellen für IVF reifen, aber nicht für die Vitrifizierung von Eizellen.
   4. Kultivieren Sie die unreifen Eizellen im GV- und MI-Stadium im ursprünglichen IVM-Kulturmedium mit Kumuluszellen für weitere 10-14 h. Wiederholen Sie die Schritte 7.6.2-7.6.3.

8. ICSI oder Eizellvitrifikation durchführen

1. Befolgen Sie das Standardverfahren des Fortpflanzungszentrums⁸.

9. Kultivieren Sie Embryonen und führen Sie eine Kryokonservierung von Embryonen durch

1. Befolgen Sie das Standardverfahren des Fortpflanzungszentrums⁸.

Ergebnisse

Bis Dezember 2019 wurde OP-IVM zur Erhaltung der Fruchtbarkeit von 274 Patienten eingesetzt. Embryologische und reproduktive Ergebnisse von 158 Patienten zwischen 2014 und 2016 wurden in einer früheren Arbeit veröffentlicht⁸. Im folgenden Beispiel wird das Verfahren für einen PCOS-Patienten beschrieben, der 2016 OP-IVM erhielt. Der Patient ist ein 28-Jähriger, bei dem primäre Unfruchtbarkeit, linke Adnexzyste und PCOS diagnostiziert wurden. Sie erhielt am^...

Diskussion

Die in diesem Artikel beschriebene OP-IVM-Methode erstreckt sich auf konventionelle IVM-Anwendungen und kombiniert IVM nach Eizellentnahme mit routinemäßigen gynäkologischen Operationen. Eizellen, die in der gynäkologischen Chirurgie verloren gegangen wären, können nun ohne zusätzliche chirurgische Risiken für IVF-ET oder FP verwendet werden. OP-IVM wurde zuerst verwendet, um Eizellen vor dem Eierstockbohren bei PCOS-Patienten zu entnehmen. Seine Anwendung weitete sich bald auf unfruchtbare Patienten aus, die ein...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
19 G single-lumen aspiration needles	Cook, Australia	K-OPS-7035-REH-ET
4-well plate	Corning
70 μm nylon cell strainer	Falcon, USA	352350
CO2 Incubator	Thermo
Culture oil	Vitrolife, Sweden	10029,OVOIL	Step 3.2.
FSH & LH	Ferring Reproductive Health, Germany	MENOPUR®
Glass Pasteur pipette	Hilgenberg GmbH, Germany	3154102-26
G-MOPS medium			pH-stable handling medium for washing the needle before puncturing
IVM medium	Origio, Denmark	ART-1600-B
Laminar Flow Clean Benches	ESCO
Petri dish	Thermo Fisher Scientific, Denmark	263991
pH stable handing media designed to support the handling and manipulation of oocytes and embryos outside the incubator	Vitrolife, Sweden	10130, G-MOPS PLUS	Step 7.1.
Rinse solution	Cook, Australia	K-SIFB-100
Stereoscope	Nikon