OP-IVM: Combinación de la maduración in vitro después de la recuperación de ovocitos con cirugía ginecológica

Resumen

La maduración in vitro (MIV) antes de la operación ginecológica (OP-IVM) combina la IVM después de la recuperación de ovocitos con la cirugía ginecológica de rutina y sirve como una extensión de las aplicaciones convencionales de IVM para la preservación de la fertilidad.

Resumen

El uso de la maduración in vitro (MIV) antes de la operación ginecológica (OP-IVM) es una extensión de la IVM convencional que combina la IVM después de la recuperación de ovocitos con la cirugía ginecológica de rutina. OP-IVM es adecuado para pacientes sometidas a cirugía ginecológica benigna que tienen la necesidad de preservación de la fertilidad (PF) o tratamientos de infertilidad como la fertilización in vitro y la transferencia de embriones (FIV-ET). En el quirófano, las pacientes sometidas a cirugía ginecológica benigna son primero anestesiadas y reciben tratamiento de aspiración de folículo inmaduro (IMFA) guiado por ultrasonido. A medida que se realiza la cirugía ginecológica posterior, se examinan los complejos cúmulo-ovocito (AOC) y los AOC inmaduros se transfieren al medio IVM y se cultivan durante 28-32 horas en el laboratorio de FIV. Después de la evaluación, los ovocitos maduros en la etapa MII se seleccionarán y criopreservarán en nitrógeno líquido para FP o se fertilizarán mediante inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) para FIV-ET. Al combinar la IVM con la cirugía ginecológica, los ovocitos inmaduros que habrían sido descartados se pueden guardar y utilizar para la tecnología de reproducción asistida (ART). El procedimiento, la importancia y los aspectos críticos de OP-IVM se describen en este artículo.

Introducción

IVM es un TAR en el que los ovocitos inmaduros humanos se cultivan in vitro para la maduración para FIV-ET o FP. En la IVM, no se utilizan medicamentos de inducción de la ovulación, lo que reduce el dolor, la carga financiera y las complicaciones como el síndrome de hiperestimulación ovárica (SHO)^1,2. Además, la IVM es particularmente adecuada para la FP de pacientes con cáncer y el tratamiento de la infertilidad de pacientes sensibles a las hormonas que pueden no poder o no tener tiempo para recibir la terapia de inducción de la ovulación³. Por lo tanto, aunque el número de ovocitos recuperados, la tasa de embarazo clínico (RCP) y la tasa de nacidos vivos (LBR) son más bajas que las de la FIV^4,5,la IVM tiene sus propias ventajas únicas.

Las pacientes infértiles con lesiones endometriales, hidrosalpinx o quistes ováricos generalmente se someten a cirugía ginecológica antes del tratamiento con TAR, y sus ovocitos suelen ser inmaduros. OP-IVM utiliza ultrasonido transvaginal guiado para recuperar los ovocitos inmaduros y cultivarlos in vitro hasta la maduración para FIV-ET o FP. OP-IVM combina IVM después de la recuperación de ovocitos y la cirugía ginecológica, reduciendo así las complicaciones que son comunes en los ciclos controlados de hiperestimulación ovárica y ahorrando tiempo y dinero. Para los pacientes fértiles, OP-IVM podría servir como un "seguro de fertilidad" mientras se somete a una cirugía ginecológica de rutina.

Además, los daños causados por las cirugías ginecológicas, como la electrocauterización^6,7 y la resección del tumor ovárico, podrían reducirse a través de la recuperación de ovocitos antes de la cirugía ginecológica. Por lo tanto, en comparación con la cirugía ginecológica de rutina, OP-IVM podría reducir el número de operaciones durante el tratamiento de la infertilidad y prevenir la pérdida de ovocitos funcionales durante la cirugía ovárica.

Un estudio previo ha demostrado que el procedimiento adicional de recuperación de ovocitos no aumentaría las complicaciones quirúrgicas y los resultados adversos del embarazo, ni prolongaría la estancia hospitalaria⁸. Algunas pacientes han dado a luz viva a través de OP-IVM^8,lo que indica la viabilidad de este método. Este artículo describe las características de los pacientes que pueden beneficiarse de OP-IVM, así como los procedimientos y puntos críticos de OP-IVM y discute la evaluación de la madurez de los ovocitos humanos.

Protocolo

NOTA: Los estudios relacionados con el método OP-IVM han sido aprobados por la junta de revisión institucional (IRB) del Tercer Hospital de la Universidad de Pekín y el Comité de Ética de la Universidad de Pekín (2014S2004). En la Figura 1se muestra un resumen de OP-IVM. El procedimiento paso a paso se introducirá en la siguiente sección.

1. Introducción de OP-IVM a pacientes apropiados

1. Identificar pacientes potenciales que puedan beneficiarse de OP-IVM como los descritos en los pasos 1.1.1-1.1.3.:
   1. Pacientes con síndrome de ovario poliquístico (SOP) con resistencia al clomifeno que necesitan cirugía de perforación ovárica laparoscópica.
   2. Pacientes infértiles que necesitan cirugías ginecológicas benignas, como miomectomía histeroscópica, polipectomía, resección transcervical del tabique y cirugía tubárica laparoscópica, y ooforocistectomía, antes del tratamiento con TARV.
   3. Pacientes con cáncer o enfermedad hematológica que están recibiendo quimiorradioterapia o radioterapia.

2. Consentimiento informado

1. Proporcionar información completa a los pacientes, incluyendo por qué OP-IVM puede ser beneficioso, su procedimiento, los usos de los ovocitos IVM (FIV-ET o criopreservación), RCP y LBR estimados, y posibles complicaciones. Pida a los pacientes que den su consentimiento informado firmando el formulario de consentimiento.

3. Preparar etiquetas y medio de ovocitos IVM

1. Imprima las etiquetas de identificación (ID) con el nombre y las fechas del paciente para los platos y tubos de cultivo.
2. Agregue 0.5 ml de medio IVM suplementado con 0.075 UI / ml de hormona foliculoestimulante (FSH) y 0.075 UI / ml de hormona luteinizante (LH) a cada pozo de una placa de 4 pozos. Cubra el medio con aceite.
   NOTA: Realice todos estos procedimientos en bancos limpios de flujo laminar.
3. Precalentar la placa de 4 pomos con medio de ovocitos IVM a 37 °C en aire humidificado que contenga 5% de CO₂ y 5% de O₂ al menos 6 h antes de su uso.

4. Administrar anestesia en quirófano

1. Verifique el nombre del paciente antes de administrar anestesia.
2. Anestesiar por vía intravenosa al paciente por anestesiólogo.

5. Realizar la recuperación de ovocitos

1. Etiquete las etiquetas con el nombre, la fecha y la identificación en los platos y tubos de cultivo.
2. Coloque al paciente en la posición de litotomía vesical; desinfectar, cubrir y frotar constantemente la vagina con solución salina tibia.
3. Coloque la sonda de ultrasonido dentro de la vagina; escanear y registrar el número de folículos en ambos ovarios. Encuentre la ubicación más cercana al ovario como el sitio de punción y evite el intestino, la vejiga y los vasos sanguíneos grandes.
4. Aspirar líquido folicular.
   1. Lave la aguja con un medio de manipulación de pH estable antes de perforar (consulte la Tabla de materiales).
   2. Inyecte la aguja de aspiración de un solo lumen de 19 G en los ovarios bajo la guía de ultrasonido.
   3. Punción de folículos más grandes con límites claros más cercanos a la sonda. En una posición baja, inyecte rápidamente la solución de enjuague suplementada con 25 U/ml de heparina. Aspire el líquido folicular con la aguja a una presión de 80-90 mmHg, girando la aguja ligeramente para aspirar la mayor cantidad de líquido folicular posible. Perfore otros folículos del lado cercano al lejano en este plano.
      NOTA: Durante la aspiración, el líquido folicular que contiene ovocitos fluirá hacia un tubo de ensayo estéril de 10 ml bajo presión negativa. La heparina puede reducir la viscosidad del líquido folicular para facilitar el proceso de aspiración.
   4. Retire la aguja del ovario (manténgala en la pared vaginal). Ajuste la dirección de la sonda de ultrasonido y perfore los folículos restantes en otros planos. Intente aspirar todos los folículos con un diámetro de ~ 5-9 mm.
      NOTA: Ajuste la posición de la sonda para mantenerla más cerca de los ovarios en todo momento. Presione el fórnix vaginal con la fuerza adecuada para reducir las lesiones y el sangrado.
   5. Extraiga la aguja después de terminar en un ovario, lave la aguja con el medio de manipulación y perfore el otro lado con el mismo método.
      NOTA: Aspiración completa del folículo en 25-30 min.
5. Transfiera el líquido folicular de la sala de operaciones al laboratorio de FIV dentro de unos minutos después de confirmar el nombre y la identificación del paciente.
   NOTA: Transfiera el líquido folicular aspirado al banco de laboratorio de FIV lo antes posible para prevenir la coagulación.
6. Detectar hemorragia activa en la cavidad pélvica con ecografía en modo B después de perforar todos los folículos. Inserte un espéculo y apunte la punta al fórnix posterior para detectar sangrado activo en el sitio de la punción.
   NOTA: No se debe observar sangrado activo en el sitio de punción vaginal si la posición del ovario es normal y la recuperación de ovocitos se realiza con cuidado. Para un sangrado leve que continúa incluso después de la compresión, mantenga una compresa de gasa estéril en la vagina durante 2-4 h. Controle el sangrado excesivo de las arterias pequeñas utilizando pinzas con pinzas vasculares durante 2-4 h. El sangrado en la cavidad pélvica u ovario, que rara vez ocurre, debe controlarse mediante electrocoagulación mediante cirugía laparoscópica.

6. Cirugía ginecológica

1. En función de la necesidad y la condición de la paciente, realice la cirugía ginecológica adecuada después de la recuperación de ovocitos.
   1. Realizar cirugía laparoscópica de perforación ovárica para pacientes con síndrome de ovario poliquístico (SOP) con resistencia al clomifeno.
   2. Realizar cirugía ginecológica benigna para pacientes infértiles antes del tratamiento con TAR, como miomectomía histeroscópica, polipectomía, resección transcervical del tabique y cirugía tubárica laparoscópica, y ooforocistectomía.
   3. Realizar ovariectomía para la criopreservación de la fertilidad de pacientes con cáncer o enfermedad hematológica que necesiten recibir quimiorradioterapia.
      NOTA: Estas cirugías ginecológicas son operaciones clínicas básicas y estandarizadas. Las pautas de operación en varios países y hospitales deben ser relativamente similares.

7. Realizar IVM

NOTA: Realizar todo el proceso de IVM en un plano homotérmico de 37 °C.

1. Filtre el líquido del folículo aspirado con un colador de células de nylon de 70 μm. Enjuague repetidamente el tubo de cultivo y el colador con un medio de manipulación de pH estable precalentado. Asegúrese de que todos los AOC inmaduros se transfieran completamente al plato de cultivo. Recoger el líquido filtrado, enjuagar y cultivar en una placa de Petri de 100 x 15 mm.
2. Examine los ACO (Figura 2) bajo el estereoscopio con un aumento de 40x. Transfiera rápidamente los inmaduros a un medio de ovocitos IVM precalentado.
   NOTA: Elija un aumento apropiado dependiendo del hábito del operador.
3. Registre el número de AOC inmaduros cultivados.
4. Informar al paciente sobre el número de AOC cultivados. Discuta la recolección de semen con los pacientes y sus parejas. Realizar la extracción de espermatozoides de acuerdo con el procedimiento normal.
5. Culture los AOC inmaduros a 37 °C en aire humidificado que contenga 5% de CO2 y 5% de O₂ durante 28-32 h.
6. Evaluar la madurez de los ovocitos.
   1. Denude las células del cúmulo mediante pipeteo repetido usando una pipeta Pasteur de vidrio debajo del estereoscopio con aumento de 40x. Examinar la extrusión del cuerpo polar (PB) para identificar la etapa de desarrollo de los ovocitos. Consulte la Figura 2 para obtener imágenes representativas de ovocitos en AOCs, metafase II (MII), metafase I (MI) y vesículas germinales (GV) con características morfológicas claras.
      NOTA: Utilice una llama vertical (por ejemplo, de un quemador Bunsen) para ajustar el diámetro de la pipeta Pasteur de vidrio al tamaño de un ovocito.
   2. Cuente los ovocitos MII y registre el número.
   3. Elija ovocitos maduros para FIV o vitrificación.
      NOTA: Recolecte esperma el día en que los ovocitos maduran para la FIV, pero no para la vitrificación de ovocitos.
   4. Culta los ovocitos inmaduros en la etapa GV e IM en el medio de cultivo IVM original con células cúmulos durante otras 10-14 h. Repita los pasos 7.6.2-7.6.3.

8. Realizar ICSI o vitrificación de ovocitos

1. Siga el procedimiento estándar del centro reproductivo⁸.

9. Cultivar embriones y realizar criopreservación embrionaria

1. Siga el procedimiento estándar del centro reproductivo⁸.

Resultados

Hasta diciembre de 2019, OP-IVM se utilizó para la preservación de la fertilidad de 274 pacientes. Los resultados embriológicos y reproductivos de 158 pacientes entre 2014 y 2016 se publicaron en un artículo anterior⁸. En el siguiente ejemplo se describe el procedimiento seguido para un paciente con SOP que recibió OP-IVM en 2016. El paciente es un joven de 28 años diagnosticado con infertilidad primaria, quiste anexial izquierdo y SOP. Recibió cistectomía ...

Discusión

El método OP-IVM descrito en este artículo se extiende a las aplicaciones convencionales de IVM y combina IVM después de la recuperación de ovocitos con cirugía ginecológica de rutina. Los ovocitos que se habrían perdido en la cirugía ginecológica ahora se pueden usar para FIV-ET o FP sin riesgos quirúrgicos adicionales. OP-IVM se utilizó por primera vez para recuperar ovocitos antes de la perforación ovárica en pacientes con SOP. Su aplicación pronto se expandió a pacientes infértiles que necesitan cirug...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
19 G single-lumen aspiration needles	Cook, Australia	K-OPS-7035-REH-ET
4-well plate	Corning
70 μm nylon cell strainer	Falcon, USA	352350
CO2 Incubator	Thermo
Culture oil	Vitrolife, Sweden	10029,OVOIL	Step 3.2.
FSH & LH	Ferring Reproductive Health, Germany	MENOPUR®
Glass Pasteur pipette	Hilgenberg GmbH, Germany	3154102-26
G-MOPS medium			pH-stable handling medium for washing the needle before puncturing
IVM medium	Origio, Denmark	ART-1600-B
Laminar Flow Clean Benches	ESCO
Petri dish	Thermo Fisher Scientific, Denmark	263991
pH stable handing media designed to support the handling and manipulation of oocytes and embryos outside the incubator	Vitrolife, Sweden	10130, G-MOPS PLUS	Step 7.1.
Rinse solution	Cook, Australia	K-SIFB-100
Stereoscope	Nikon