OP-IVM: Oosit Alımından Sonra In vitro Olgunlaşmayı Jinekolojik Cerrahi ile Birleştirmek

Özet

Jinekolojik operasyondan önce in vitro olgunlaşma (IVM) (OP-IVM), oosit alımını takiben IVM'yi rutin jinekolojik cerrahi ile birleştirir ve doğurganlığın korunması için geleneksel IVM uygulamalarının bir uzantısı olarak hizmet eder.

Özet

Jinekolojik operasyondan (OP-IVM) önce in vitro olgunlaşma (IVM) kullanımı, oosit alımını takiben IVM'i rutin jinekolojik cerrahi ile birleştiren geleneksel IVM'nin bir uzantısıdır. OP-IVM, doğurganlığın korunmasına (FP) veya in vitro fertilizasyon ve embriyo transferi (IVF-ET) gibi kısırlık tedavilerine ihtiyaç duyan iyi huylu jinekolojik cerrahi uygulanan hastalar için uygundur. Ameliyathanede iyi huylu jinekolojik cerrahi uygulanan hastalar önce uyuşturulur ve ultrason eşliğinde olgunlaşmamış folikül aspirasyonu (IMFA) tedavisi görürler. Sonraki jinekolojik cerrahi yapıldıkça kümülüs-oosit kompleksleri (COC) incelenir ve olgunlaşmamış COC'ler IVM ortamına aktarılır ve IVF laboratuvarında 28-32 saat kültürlenir. Değerlendirmeden sonra, MII aşamasındaki olgun oositler seçilecek ve FP için sıvı nitrojende kriyoprezite veya IVF-ET için intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) ile döllenecektir. IVM'yi jinekolojik cerrahi ile birleştirerek, atılacak olgunlaşmamış oositler kaydedilebilir ve yardımcı üreme teknolojisi (ART) için kullanılabilir. OP-IVM'nin prosedürü, önemi ve kritik yönleri bu makalede açıklanmıştır.

Giriş

IVM, insan olgunlaşmamış oositlerin IVF-ET veya FP için olgunlaşmaya in vitro olarak kültüre olduğu bir SANATTIR. IVM'de yumurtlama indüksiyon ilaçları kullanılmaz, böylece ağrı, finansal yük ve yumurtalık hiperstimülasyon sendromu (İSG)^1,2gibi komplikasyonlar azaltılır. Ek olarak, IVM özellikle kanser hastalarının FP'si ve yumurtlama indüksiyon tedavisi alamayacak veya alacak zamanı olmayan hormona duyarlı hastaların kısırlık tedavisi için uygundur^3. Bu nedenle, alınan oosit sayısına rağmen, klinik gebelik oranı (CPR) ve canlı doğum oranı (LBR) IVF⁴,^5,IVM'den daha düşüktür.

Endometriyal lezyonları, hidrosalpinks veya yumurtalık kistleri olan infertil hastalar genellikle ART tedavisinden önce jinekolojik cerrahiye sahiptir ve oositleri genellikle olgunlaşmamıştır. OP-IVM, olgunlaşmamış oositleri almak ve IVF-ET veya FP için olgunlaşmaya kadar in vitro olarak yetiştirmek için kılavuzlu transvajinal ultrason kullanır. Doğurgan hastalar için OP-IVM, rutin jinekolojik cerrahiden geçerken "doğurganlık sigortası" görevi görebilse de.

Ayrıca elektrokoter^6,7 ve yumurtalık tümörü rezeksiyonu gibi jinekolojik ameliyatların neden olduğu hasarlar jinekolojik cerrahi öncesi oosit alımı ile azaltılabilir. Bu nedenle, rutin jinekolojik cerrahi ile karşılaştırıldığında, OP-IVM kısırlık tedavisi sırasında operasyon sayısını azaltabilir ve yumurtalık cerrahisi sırasında fonksiyonel oosit kaybını önleyebilir.

Daha önceki bir çalışma, ek oosit alma prosedürünün ne cerrahi komplikasyonları ve olumsuz gebelik sonuçlarını artıracağını ne de hastanede kalış süresini uzatacağını^{göstermiştir 8}. Bazı hastalar op-ivm⁸ile canlı doğum yapmışlardır Bu yöntemin fizibilitesini gösterir. Bu makalede OP-IVM'den yararlanabilecek hastaların özelliklerinin yanı sıra OP-IVM'nin prosedürleri ve kritik noktaları açıklanmaktadır ve insan oosit olgunluğunun değerlendirilmesi tartışılmaktadır.

Protokol

NOT: OP-IVM yöntemi ile ilgili çalışmalar Pekin Üniversitesi Üçüncü Hastanesi kurumsal inceleme kurulu (IRB) ve Pekin Üniversitesi Etik Kurulu (2014S2004) tarafından onaylanmıştır. OP-IVM'nin bir özeti Şekil 1'de gösterilmiştir. Adım adım yordam aşağıdaki bölümde tanıtılacaktır.

1. OP-IVM'nin uygun hastalara tanıtılması

1. 1.1.1-1.1.3. adımlarda açıklananlar gibi OP-IVM'den yararlanabilecek potansiyel hastaları belirleyin:
   1. Klomiphene direnci olan ve laparoskopik yumurtalık delme ameliyatına ihtiyaç duyan polikistik over sendromu (PKOS) hastaları.
   2. ART tedavisinden önce histoskopik miyotektomi, polipektomi, septum ve laparoskopik tubal cerrahinin transerviktal rezeksiyonu ve ophorosistektomi gibi iyi huylu jinekolojik ameliyatlara ihtiyaç duyan infertil hastalar.
   3. Kemoradyoterapi veya radyoterapi alan kanser veya hematolojik hastalığı olan hastalar.

2. Bilgilendirilmiş onay

1. OP-IVM'nin neden faydalı olabileceği, prosedürü, IVM oositlerinin (IVF-ET veya kriyoprezervasyon) kullanımı, tahmini CPR'ler ve LBR'ler ve olası komplikasyonlar dahil olmak üzere hastalara tam bilgi sağlayın. Hastalardan onay formunu imzalayarak bilinçli onay vermelerini isteyin.

3. Etiketleri ve IVM oosit ortamını hazırlayın

1. Kültür yemekleri ve tüpler için hastanın adının ve tarihlerinin yazılı olduğu kimlik (kimlik) etiketlerini yazdırın.
2. 4 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 0.075 IU/mL folikül uyarıcı hormon (FSH) ve 0.075 IU/mL luteinize edici hormon (LH) ile desteklenmiş 0.5 mL IVM ortamı ekleyin. Ortamı yağ ile örtün.
   NOT: Tüm bu işlemleri laminer akışlı temiz banklarda gerçekleştirin.
3. 37 °C'de IVM oosit orta boylu 4 kuyulu plakayı, kullanımdan önce %5 CO₂ ve %5 O₂ içeren nemlendirilmiş havada ön ısıtma.

4. Ameliyathanede anestezi uygulamak

1. Anestezi uygulamadan önce hastanın adını kontrol edin.
2. Anestezi uzmanı tarafından intravenöz anestezik hastaya uyuşturun.

5. Oosit alma işlemi gerçekleştirin

1. Etiketleri kültür yemeklerinde ve tüplerinde ad, tarih ve kimlikle etiketleyin.
2. Hastayı mesane litotomi pozisyonuna yerleştirin; vajinayı sürekli dezenfekte edin, örtün ve ılık salinle ovalayın.
3. Ultrason probünü vajinanın içine yerleştirin; her iki yumurtalıktaki folikül sayısını tarayın ve kaydedin. Delinme bölgesi olarak yumurtalığa en yakın yeri bulun ve bağırsak, mesane ve büyük kan damarlarından kaçının.
4. Foliküler sıvıyı aspirat.
   1. Delinmeden önce iğneyi pH kararlı taşıma ortamı ile yıkayın (bkz. Malzeme Tablosu).
   2. Ultrason rehberliğinde yumurtalıklara 19 G, tek lümen aspirasyon iğnesi enjekte edin.
   3. Proba en yakın net sınırlara sahip daha büyük folikülleri delin. Düşük bir konumda, 25 U/mL heparin ile desteklenmiş durulama çözeltisini hızlı bir şekilde enjekte edin. Foliküler sıvıyı 80-90 mmHg basınç altında iğne ile aspire edin, iğneyi mümkün olduğunca fazla foliküler sıvıyı epire etmek için hafifçe döndürün. Bu düzlemde diğer folikülleri yakın mesafeden delin.
      NOT: Aspirasyon sırasında, oosit içeren foliküler sıvı negatif basınç altında steril 10 mL test tüpüne akacaktır. Heparin, aspirasyon sürecini kolaylaştırmak için foliküler sıvı viskozitesini azaltabilir.
   4. İğneyi yumurtalıktan çıkarın (iğneyi vajinal duvarda tutun). Ultrason probunun yönünü ayarlayın ve diğer düzlemlerde kalan folikülleri delin. ~5-9 mm çapında tüm folikülleri aspire etmeye çalışın.
      NOT: Probun konumunu yumurtalıklara her zaman en yakın tutacak şekilde ayarlayın. Yaralanmayı ve kanamayı azaltmak için vajinal fornix'e uygun kuvvetle bastırın.
   5. Bir yumurtalıkta bitirdikten sonra iğneyi çekin, iğneyi taşıma ortamıyla yıkayın ve aynı yöntemi kullanarak diğer tarafı delin.
      NOT: 25-30 dakika içinde komple folikül aspirasyonu.
5. Foliküler sıvıyı hastanın adını ve kimliği doğrulandıktan sonra birkaç dakika içinde ameliyat odasından tüp bebek laboratuvarına aktarın.
   NOT: Koagülasyonu önlemek için aspire foliküler sıvıyı en kısa sürede IVF laboratuvar tezgahına aktarın.
6. Tüm folikülleri deldikten sonra B-mod ultrason ile pelvik boşlukta aktif kanamayı tespit edin. Bir spekulum yerleştirin ve delinme yerindeki aktif kanamayı tespit etmek için ucu arka fornix'e doğru yöneltin.
   NOT: Yumurtalık pozisyonu normalse ve oosit alımı dikkatli bir şekilde yapılırsa vajinal delinme yerinde aktif kanama görülmemelidir. Sıkıştırmadan sonra bile devam eden hafif kanamalar için vajinada steril bir gazlı bez kompresini 2-4 saat tutun. 2-4 saat boyunca damar forsepsli kelepçeler kullanarak küçük arterlerden aşırı kanamayı kontrol edin. Nadiren olan pelvik boşluk veya yumurtalıktaki kanamalar laparoskopik cerrahi ile elektrokoagülasyon ile kontrol altına alınmalıdır.

6. Jinekolojik cerrahi

1. Hastanın ihtiyacına ve durumuna göre, oosit alımından sonra uygun jinekolojik cerrahiyi gerçekleştirin.
   1. Klomiphene direnci olan polikistik over sendromu (PKOS) hastaları için laparoskopik yumurtalık delme ameliyatı gerçekleştirin.
   2. Histoskopik miyotektomi, polipektomi, septum ve laparoskopik tubal cerrahinin transerviktal rezeksiyonu ve ophorosistektomi gibi ART tedavisinden önce infertil hastalar için iyi huylu jinekolojik cerrahi gerçekleştirin.
   3. Kemoradyoterapi alması gereken kanser veya hematolojik hastalığı olan hastaların doğurganlık kriyoprezervasyonu için ovariektomi gerçekleştirin.
      NOT: Bu jinekolojik ameliyatlar temel ve standartlaştırılmış klinik operasyonlardır. Çeşitli ülkelerdeki ve hastanelerdeki operasyon kılavuzları nispeten benzer olmalıdır.

7. IVM gerçekleştirin

NOT: IVM'nin tüm işlemini 37 °C homotermal düzlükte gerçekleştirin.

1. Emişli folikül sıvısını 70 μm naylon hücre süzgeci ile filtreleyin. Kültür tüpünü ve süzgeci önceden ısıtılmış pH-kararlı yol tutuş ortamı ile tekrar tekrar durulayın. Tüm olgunlaşmamış COC'lerin tamamen kültür çanağından aktarıldığından emin olun. Filtrelenmiş sıvıyı, durulamayı ve kültürü 100 x 15 mm Petri kabında toplayın.
2. Stereoskop altındaki COC'leri (Şekil 2)40x büyütme ile inceleyin. Olgunlaşmamışları önceden ısıtılmış bir IVM oosit ortamına hızlı bir şekilde aktarın.
   NOT: Operatörün alışkanlığına bağlı olarak uygun bir büyütme seçin.
3. Kültürlü olgunlaşmamış COC sayısını kaydedin.
4. Hastayı kültürlü COC sayısı hakkında bilgilendirin. Hastalar ve partnerleri ile sperm toplamayı tartışın. Sperm ekstraksiyonu normal prosedüre göre gerçekleştirin.
5. Olgunlaşmamış COC'leri 37 °C'de% 5 CO2 ve 28-32 saat boyunca% 5 O₂ içeren nemli havada kültürlendir.
6. Oosit olgunluğunu değerlendirin.
   1. 40x büyütme ile stereoskop altında bir cam Pasteur pipet kullanarak tekrarlanan pipetleme ile kümülüs hücrelerini denude. Oositlerin gelişim aşamasını tanımlamak için kutup gövdesinin (PB) ekstrüzyonunu inceleyin. COC'lerdeki oositlerin, metafaz II'nin (MII), metafaz I'in (MI) ve açık morfolojik özelliklere sahip germinal veziküllerin (GV) temsili görüntüleri için Şekil 2'ye bakın.
      NOT: Cam Pasteur pipetin çapını bir oosit boyutuna ayarlamak için dikey bir alev (örneğin, bir Bunsen brülörü) kullanın.
   2. MII oositlerini sayın ve sayıyı kaydedin.
   3. IVF veya vitrifikasyon için olgun oositler seçin.
      NOT: Oositlerin IVF için olgunlaştığı gün sperm toplayın, ancak oosit vitrifikasyonu için değil.
   4. Orijinal IVM kültür ortamında GV ve MI aşamasında olgunlaşmamış oositleri kümülüs hücreleriyle 10-14 saat daha kültür edin. 7.6.2-7.6.3 adımlarını yineleyin.

8. ICSI veya oosit vitrifikasyonu gerçekleştirin

1. Üreme merkezinin standart prosedürünü izleyin⁸.

9. Embriyoları kültüre edin ve embriyo kriyoprezervasyonu gerçekleştirin

1. Üreme merkezinin standart prosedürünü izleyin⁸.

Sonuçlar

Aralık 2019'a kadar OP-IVM 274 hastanın doğurganlık korunmasında kullanıldı. 2014-2016 yılları arasında 158 hastanın embriyolojik ve üreme sonuçları daha önceki bir makalede^{yayınlanmıştır 8.} Aşağıdaki örnekte, 2016 yılında OP-IVM alan bir PCOS hastası için izlenen prosedür açıklar. Hasta primer kısırlık, sol adneksal kist ve PKOS tanısı alan 28 yaşında bir hastadır. 28 Eylül 2016'da laparoskopik sistektomi ve OP-IVM aldı;

Tartışmalar

Bu makalede açıklanan OP-IVM yöntemi konvansiyonel IVM uygulamalarına uzanır ve oosit alımından sonra IVM'yi rutin jinekolojik cerrahi ile birleştirir. Jinekolojik cerrahide kaybolacak oositler artık ek cerrahi riskler olmadan IVF-ET veya FP için kullanılabilir. OP-IVM ilk olarak PKOS hastalarında yumurtalık delmeden önce oositleri almak için kullanılmıştır. Uygulaması kısa sürede iyi huylu jinekolojik cerrahiye ve kanser veya hematolojik hastalık hastalarına ihtiyaç duyan ve kemoradyoterapiye ih...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
19 G single-lumen aspiration needles	Cook, Australia	K-OPS-7035-REH-ET
4-well plate	Corning
70 μm nylon cell strainer	Falcon, USA	352350
CO2 Incubator	Thermo
Culture oil	Vitrolife, Sweden	10029,OVOIL	Step 3.2.
FSH & LH	Ferring Reproductive Health, Germany	MENOPUR®
Glass Pasteur pipette	Hilgenberg GmbH, Germany	3154102-26
G-MOPS medium			pH-stable handling medium for washing the needle before puncturing
IVM medium	Origio, Denmark	ART-1600-B
Laminar Flow Clean Benches	ESCO
Petri dish	Thermo Fisher Scientific, Denmark	263991
pH stable handing media designed to support the handling and manipulation of oocytes and embryos outside the incubator	Vitrolife, Sweden	10130, G-MOPS PLUS	Step 7.1.
Rinse solution	Cook, Australia	K-SIFB-100
Stereoscope	Nikon