OP-IVM: Combinando Maturação In vitro após Recuperação de Oócito com Cirurgia Ginecológica

Resumo

Maturação in vitro (IVM) antes da operação ginecológica (OP-IVM) combina IVM após recuperação de oócito com cirurgia ginecológica de rotina e serve como uma extensão das aplicações convencionais de IVM para preservação da fertilidade.

Resumo

O uso de maturação in vitro (IVM) antes da operação ginecológica (OP-IVM) é uma extensão do IVM convencional que combina IVM após a recuperação de oócito com cirurgia ginecológica de rotina. O OP-IVM é adequado para pacientes submetidos a cirurgia ginecológica benigna que tenham a necessidade de tratamentos de preservação da fertilidade (FP) ou infertilidade, como fertilização in vitro e transferência de embriões (FIV-ET). Na sala de cirurgia, os pacientes submetidos à cirurgia ginecológica benigna são primeiro anestesiados e recebem tratamento de aspiração imatura de folículos guiado por ultrassom (IMFA). À medida que a cirurgia ginecológica subsequente é realizada, os complexos cumulus-oocyte (COCs) são examinados, e os COCs imaturos são transferidos para o meio IVM e cultivados por 28-32 horas no laboratório de FIV. Após a avaliação, os oócitos maduros na fase MII serão selecionados e criopreservados em nitrogênio líquido para FP ou fertilizados por injeção intracytoplasmática de espermatozoides (ICSI) para FIV-ET. Combinando IVM com cirurgia ginecológica, oócitos imaturos que teriam sido descartados podem ser salvos e utilizados para tecnologia reprodutiva assistida (TARV). O procedimento, a significância e os aspectos críticos do OP-IVM estão descritos neste artigo.

Introdução

IVM é uma ARTE na qual oócitos imaturos humanos são cultivados in vitro à maturação para FIV-ET ou FP. No IVM, não são utilizados medicamentos de indução de ovulação, reduzindo assim dor, carga financeira e complicações como síndrome de hiperestimulação ovariana (SSS)^1,2. Além disso, o IVM é particularmente adequado para a FP de pacientes com câncer e para o tratamento de infertilidade de pacientes sensíveis ao hormônio que podem ser incapazes ou não têm tempo para receber a terapia de indução de ovulação³. Portanto, embora o número de oócitos recuperados, a taxa de gravidez clínica (RCP) e a taxa de natalidade viva (LBR) sejam inferiores às da FIV^4,5, o IVM tem suas próprias vantagens únicas.

Pacientes inférteis com lesões endometrial, hidrosalpinx ou cistos ovarianos geralmente fazem cirurgia ginecológica antes do tratamento da TARV, e seus oócitos são geralmente imaturos. OP-IVM usa ultrassom transvaginal guiado para recuperar os oócitos imaturos e cultivá-los in vitro até a maturação para FIV-ET ou FP. OP-IVM combina IVM após recuperação de oócitos e cirurgia ginecológica, reduzindo assim complicações comuns em ciclos de hiperestimulação ovariana controlada e economizando tempo e dinheiro. Para pacientes férteis, o OP-IVM poderia servir como um "seguro de fertilidade" enquanto se submete a cirurgia ginecológica de rotina.

Além disso, danos causados por cirurgias ginecológicas, como a ressecção do tumor eletrocauteno^6,7 e ovário, poderiam ser reduzidos através da recuperação de oócitos antes da cirurgia ginecológica. Portanto, em comparação com a cirurgia ginecológica de rotina, o OP-IVM poderia reduzir o número de operações durante o tratamento de infertilidade e evitar a perda de oócitos funcionais durante a cirurgia ovariana.

Estudo anterior mostrou que o procedimento adicional de recuperação de oócitos não aumentaria as complicações cirúrgicas e os desfechos adversos da gravidez, nem prolongaria a internação^{hospitalar 8}. Alguns pacientes deram à luz ao vivo através do OP-IVM^8,indicando a viabilidade desse método. Este artigo descreve características de pacientes que podem se beneficiar do OP-IVM, bem como procedimentos e pontos críticos do OP-IVM e discute a avaliação da maturidade oócito humana.

Protocolo

NOTA: Estudos relacionados ao método OP-IVM foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) do Terceiro Hospital da Universidade de Pequim e pelo Comitê de Ética da Universidade de Pequim (2014S2004). Um resumo do OP-IVM é mostrado na Figura 1. O procedimento passo a passo será introduzido na seção seguinte.

1. Introdução do OP-IVM aos pacientes apropriados

1. Identificar pacientes potenciais que possam se beneficiar do OP-IVM, como os descritos nas etapas 1.1.1-1.1.3.:
   1. Pacientes com síndrome ovariana policística (SPC) com resistência ao clomifeneno que precisam de cirurgia de perfuração ovariana laparoscópica.
   2. Pacientes inférteis que necessitam de cirurgias ginecológicas benignas, como miomectomia histeroscópica, polipectomia, ressecção transcervical de septo e cirurgia tubal laparoscópica, e oophorocistectomia, antes do tratamento da TARV.
   3. Pacientes com câncer ou doença hematológica que estejam recebendo quimiodioterapia ou radioterapia.

2. Consentimento informado

1. Fornecer informações completas aos pacientes, incluindo por que o OP-IVM pode ser benéfico, seu procedimento, uso de oócitos IVM (FIV-ET ou criopreservação), CPRs e LBRs estimados e possíveis complicações. Peça aos pacientes que dêem consentimento informado assinando o termo de consentimento.

3. Prepare rótulos e meio oócito IVM

1. Etiquetas de identificação de impressão (RG) com o nome do paciente e datas para pratos e tubos de cultura.
2. Adicione 0,5 mL de IVM médio suplementado com 0,075 UI/mL de hormônio estimulante do folículo (FSH) e 0,075 UI/mL de hormônio luteinizador (LH) a cada poço de uma placa de 4 poços. Cubra o meio com óleo.
   NOTA: Realize todos esses procedimentos em bancos de limpeza de fluxo laminar.
3. Pré-aquecimento a placa de 4-poço com ivm oócito médio a 37 °C em ar umidificado contendo 5% DE CO₂ e 5% O₂ pelo menos 6 h antes do uso.

4. Administrar anestesia em uma sala de cirurgia

1. Verifique o nome do paciente antes de administrar anestesia.
2. Anestesiar o paciente por anestesista.

5. Realizar recuperação de oócito

1. Marque os rótulos com nome, data e identificação nos pratos e tubos de cultura.
2. Coloque o paciente na posição de litotomia da bexiga; constantemente desinfetar, cobrir e esfregar a vagina com soro fisiológico quente.
3. Coloque a sonda de ultrassom dentro da vagina; digitalize e regise o número de folículos em ambos os ovários. Encontre o local mais próximo do ovário como local de punção, e evite o intestino, bexiga e vasos sanguíneos grandes.
4. Fluido folicular aspirado.
   1. Lave a agulha com meio de manuseio estável de pH antes de perfurar (ver Tabela de Materiais).
   2. Injete a agulha de aspiração de 19 G, monomúmen nos ovários sob a orientação do ultrassom.
   3. Puna folículos maiores com limites claros mais próximos da sonda. Em posição baixa, injete rapidamente a solução de enxágue complementada com 25 U/mL de heparina. Aspirar fluido folicular com a agulha sob uma pressão de 80-90 mmHg, girando a agulha ligeiramente para aspirar o máximo de fluido folicular possível. Perfure outros folículos do lado de perto para o outro neste avião.
      NOTA: Durante a aspiração, o fluido folicular contendo oócitos fluirá em um tubo de ensaio estéril de 10 mL sob pressão negativa. A heparina pode reduzir a viscosidade do fluido folicular para facilitar o processo de aspiração.
   4. Retire a agulha do ovário (mantenha a agulha na parede vaginal). Ajuste a direção da sonda de ultrassom e perfure os folículos restantes em outros planos. Tente aspirar todos os folículos com um diâmetro de ~5-9 mm.
      NOTA: Ajuste a posição da sonda para mantê-la mais próxima dos ovários o tempo todo. Pressione o fornix vaginal com força apropriada para reduzir lesões e sangramento.
   5. Retire a agulha depois de terminar em um ovário, lave a agulha com o meio de manuseio e puna o outro lado usando o mesmo método.
      NOTA: Aspiração folículo completa dentro de 25-30 min.
5. Transfira o fluido folicular da sala de operação para o laboratório de FIV dentro de poucos minutos após confirmar o nome e a ID do paciente.
   NOTA: Transfira o fluido folicular aspirado para o banco do laboratório de FIV o mais rápido possível para evitar a coagulação.
6. Detecte hemorragia ativa na cavidade pélvica com ultrassom no modo B após perfurar todos os folículos. Insira um espéculo e aponte a ponta no fornix posterior para detectar sangramento ativo no local da punção.
   NOTA: Nenhum sangramento ativo deve ser observado no local da punção vaginal se a posição do ovário estiver normal e a recuperação do oócito for realizada cuidadosamente. Para sangramento leve que continua mesmo após a compressão, mantenha uma compressa de gaze estéril na vagina por 2-4 h. Controle o sangramento excessivo de pequenas artérias usando grampos com fórceps vasculares por 2-4 h. Sangramento na cavidade pélvica ou ovário, que raramente acontece, deve ser controlado por eletrocoagulação por cirurgia laparoscópica.

6. Cirurgia ginecológica

1. Com base na necessidade e condição do paciente, realize cirurgia ginecológica adequada após a recuperação do oócito.
   1. Realizar cirurgia de perfuração ovariana laparoscópica para pacientes com síndrome ovariana policística (PCOS) com resistência ao clomifeno.
   2. Realizar cirurgia ginecológica benigna para pacientes inférteis antes do tratamento da TARV, como miomectomia histeroscópica, polipectomia, ressecção transcervical de septo e cirurgia tubal laparoscópica, e oophorocystectomia.
   3. Realizar a ovariectomia para criopreservação de fertilidade de pacientes com câncer ou doença hematológica que precisam receber chemoradioterapia.
      NOTA: Estas cirurgias ginecológicas são operações clínicas básicas e padronizadas. As diretrizes de operação em vários países e hospitais devem ser relativamente semelhantes.

7. Realizar IVM

NOTA: Realize todo o processo de IVM em um apartamento homotérmico de 37 °C.

1. Filtre o fluido folículo aspirado com um coador de células de nylon de 70 μm. Enxágue repetidamente o tubo de cultura e o coador com meio de manuseio pré-aquecido de pH estável. Certifique-se de que todos os COCs imaturos sejam completamente transferidos para o prato de cultura. Colete o fluido filtrado, enxágue e cultura em uma placa de Petri de 100 x 15 mm.
2. Examine os COCs(Figura 2) sob o estereoscópio com ampliação de 40x. Transfira rapidamente os imaturos para um meio de oócito IVM pré-aquecido.
   NOTA: Escolha uma ampliação adequada dependendo do hábito do operador.
3. Registre o número de COCs imaturos cultivados.
4. Informe o paciente sobre o número de COCs cultivados. Discutir a coleta de sêmen com os pacientes e seus parceiros. Realizar extração de esperma de acordo com o procedimento normal.
5. Cultura os COCs imaturos a 37 °C em ar umidificado contendo 5% de CO2 e 5% O₂ para 28-32 h.
6. Avalie a maturidade oócito.
   1. Denude as células cumulus repetidamente usando uma pipeta pasteur de vidro sob o estereoscópio com ampliação de 40x. Examine a extrusão do corpo polar (PB) para identificar o estágio de desenvolvimento dos oócitos. Consulte a Figura 2 para imagens representativas de oócitos em COCs, metafase II (MII), metafase I (MI) e vesículas germinais (GVs) com características morfológicas claras.
      NOTA: Use uma chama vertical (por exemplo, de um queimador de Bunsen) para ajustar o diâmetro da pipeta Pasteur de vidro ao tamanho de um oócito.
   2. Conte oócitos MII e regissue o número.
   3. Escolha oócitos maduros para FIV ou vitrificação.
      NOTA: Coletar esperma no dia em que os oócitos amadurecerem para fiv, mas não para vitrificação de oócitos.
   4. Cultura os oócitos imaturos em estágio GV e MI no meio original de cultura IVM com células cumulus por mais 10-14 h. Repetição passos 7.6.2-7.6.3.

8. Realize a vitrificação icsi ou oócito

1. Siga o procedimento padrão do centro reprodutivo⁸.

9. Embriões culturais e realizar criopreservação de embriões

1. Siga o procedimento padrão do centro reprodutivo⁸.

Resultados

Até dezembro de 2019, o OP-IVM era utilizado para preservação da fertilidade de 274 pacientes. Os desfechos embriológicos e reprodutivos de 158 pacientes entre 2014 e 2016 foram publicados em artigo anterior⁸. O exemplo a seguir discute o procedimento seguido para um paciente pcos que recebeu OP-IVM em 2016. O paciente é um homem de 28 anos diagnosticado com infertilidade primária, cisto adnexal e PCOS. Recebeu cistectomia laparoscópica e OP-IVM em 28 de set...

Discussão

O método OP-IVM descrito neste artigo estende-se às aplicações convencionais de IVM e combina IVM após recuperação de oócito com cirurgia ginecológica de rotina. Oócitos que teriam sido perdidos na cirurgia ginecológica podem agora ser usados para FIV-ET ou FP sem riscos cirúrgicos adicionais. OP-IVM foi usado pela primeira vez para recuperar oócitos antes da perfuração ovariana em pacientes com PCOS. Sua aplicação logo se expandiu para pacientes inférteis que precisam de cirurgia ginecológica benigna ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
19 G single-lumen aspiration needles	Cook, Australia	K-OPS-7035-REH-ET
4-well plate	Corning
70 μm nylon cell strainer	Falcon, USA	352350
CO2 Incubator	Thermo
Culture oil	Vitrolife, Sweden	10029,OVOIL	Step 3.2.
FSH & LH	Ferring Reproductive Health, Germany	MENOPUR®
Glass Pasteur pipette	Hilgenberg GmbH, Germany	3154102-26
G-MOPS medium			pH-stable handling medium for washing the needle before puncturing
IVM medium	Origio, Denmark	ART-1600-B
Laminar Flow Clean Benches	ESCO
Petri dish	Thermo Fisher Scientific, Denmark	263991
pH stable handing media designed to support the handling and manipulation of oocytes and embryos outside the incubator	Vitrolife, Sweden	10130, G-MOPS PLUS	Step 7.1.
Rinse solution	Cook, Australia	K-SIFB-100
Stereoscope	Nikon