JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Erratum Notice
  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Erratum
  • Ristampe e Autorizzazioni

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Riepilogo

La maturazione in vitro (IVM) prima dell'operazione ginecologica (OP-IVM) combina l'IVM dopo il prelievo degli ovociti con la chirurgia ginecologica di routine e funge da estensione delle applicazioni IVM convenzionali per la conservazione della fertilità.

Abstract

L'uso della maturazione in vitro (IVM) prima dell'operazione ginecologica (OP-IVM) è un'estensione dell'IVM convenzionale che combina l'IVM dopo il prelievo degli ovociti con la chirurgia ginecologica di routine. OP-IVM è adatto per i pazienti sottoposti a chirurgia ginecologica benigna che hanno la necessità di preservare la fertilità (FP) o trattamenti di infertilità come la fecondazione in vitro e il trasferimento di embrioni (IVF-ET). In sala operatoria, i pazienti sottoposti a chirurgia ginecologica benigna vengono prima anestetizzati e ricevono un trattamento di aspirazione del follicolo immaturo (IMFA) guidato da ultrasuoni. Quando viene eseguita la successiva chirurgia ginecologica, vengono esaminati i complessi cumulo-ovocita (COC) e i COC immaturi vengono trasferiti nel mezzo IVM e coltivati per 28-32 ore nel laboratorio di fecondazione in vitro. Dopo la valutazione, gli ovociti maturi nella fase MII saranno selezionati e crioconservati in azoto liquido per FP o fecondati mediante iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI) per IVF-ET. Combinando L'IVM con la chirurgia ginecologica, gli ovociti immaturi che sarebbero stati scartati possono essere salvati e utilizzati per la tecnologia di riproduzione assistita (ART). La procedura, il significato e gli aspetti critici di OP-IVM sono descritti in questo articolo.

Introduzione

IVM è una ART in cui gli ovociti umani immaturi vengono coltivati in vitro fino alla maturazione per IVF-ET o FP. In IVM, i farmaci di induzione dell'ovulazione non vengono utilizzati, riducendo così il dolore, l'onere finanziario e le complicanze come la sindrome da iperstimolazione ovarica (OHSS)1,2. Inoltre, IVM è particolarmente adatto per la FP di pazienti oncologici e il trattamento dell'infertilità di pazienti ormono-sensibili che potrebbero non essere in grado o non avere il tempo di ricevere la terapia di induzione dell'ovulazione3. Pertanto, sebbene il numero di ovociti recuperati, il tasso di gravidanza clinica (CPR) e il tasso di natalità vivo (LBR) siano inferiori a quelli della fecondazione in vitro4,5, IVM ha i suoi vantaggi unici.

I pazienti infertili con lesioni endometriali, idrosalpinx o cisti ovariche di solito hanno un intervento chirurgico ginecologico prima del trattamento con ART e i loro ovociti sono solitamente immaturi. OP-IVM utilizza l'ecografia transvaginale guidata per recuperare gli ovociti immaturi e farli crescere in vitro fino alla maturazione per IVF-ET o FP. OP-IVM combina IVM dopo il prelievo degli ovociti e la chirurgia ginecologica, riducendo così le complicanze che sono comuni nei cicli di iperstimolazione ovarica controllata e risparmiando tempo e denaro. Per i pazienti fertili, OP-IVM potrebbe servire come "assicurazione sulla fertilità" durante la chirurgia ginecologica di routine.

Inoltre, i danni causati da interventi chirurgici ginecologici, come l'elettrocauteria6,7 e la resezione del tumore ovarico, potrebbero essere ridotti attraverso il recupero degli ovociti prima della chirurgia ginecologica. Pertanto, rispetto alla chirurgia ginecologica di routine, OP-IVM potrebbe ridurre il numero di operazioni durante il trattamento dell'infertilità e prevenire la perdita di ovociti funzionali durante la chirurgia ovarica.

Uno studio precedente ha dimostrato che la procedura aggiuntiva di recupero degli ovociti non aumenterebbe le complicanze chirurgiche e gli esiti avversi della gravidanza, né prolungherebbe la degenza ospedaliera8. Alcune pazienti hanno partorito vivo attraverso OP-IVM8, indicando la fattibilità di questo metodo. Questo documento descrive le caratteristiche dei pazienti che possono trarre beneficio da OP-IVM, nonché le procedure e i punti critici di OP-IVM e discute la valutazione della maturità degli ovociti umani.

Protocollo

NOTA: Gli studi relativi al metodo OP-IVM sono stati approvati dal comitato di revisione istituzionale (IRB) del Terzo Ospedale universitario di Pechino e dal comitato etico dell'Università di Pechino (2014S2004). Un riepilogo di OP-IVM è mostrato nella Figura 1. La procedura dettagliata verrà introdotta nella sezione seguente.

1. Introduzione di OP-IVM a pazienti appropriati

  1. Identificare i potenziali pazienti che possono trarre beneficio da OP-IVM come quelli descritti nei passaggi 1.1.1-1.1.3.:
    1. Sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) pazienti con resistenza al clomifene che necessitano di un intervento chirurgico di perforazione ovarica laparoscopica.
    2. Pazienti infertili che necessitano di interventi chirurgici ginecologici benigni, come miomectomia isteroscopica, polipectomia, resezione transcervicale del setto e chirurgia tubarica laparoscopica e ovariocistectomia, prima del trattamento ART.
    3. Pazienti con cancro o malattia ematologica che stanno ricevendo chemioradioterapia o radioterapia.

2. Consenso informato

  1. Fornire informazioni complete ai pazienti, incluso il motivo per cui OP-IVM può essere utile, la sua procedura, gli usi degli ovociti IVM (IVF-ET o crioconservazione), CCR e LDR stimati e possibili complicanze. Chiedere ai pazienti di dare il consenso informato firmando il modulo di consenso.

3. Preparare etichette e mezzo ovocitario IVM

  1. Stampare etichette di identificazione (ID) con il nome e le date del paziente per piatti e tubi di coltura.
  2. Aggiungere 0,5 mL di IVM medio integrato con 0,075 UI / mL di ormone follicolo-stimolante (FSH) e 0,075 UI / mL di ormone luteinizzante (LH) a ciascun pozzetto di una piastra a 4 pozzetti. Coprire il mezzo con olio.
    NOTA: eseguire tutte queste procedure in banchi puliti a flusso laminare.
  3. Preriscaldare la piastra a 4 pozzi con ovocita IVM medium a 37 °C in aria umidificata contenente il 5% di CO2 e il 5% di O2 almeno 6 ore prima dell'uso.

4. Somministrare l'anestesia in una sala operatoria

  1. Controllare il nome del paziente prima di somministrare l'anestesia.
  2. Anestetizzare per via endovenosa il paziente dall'anestesista.

5. Eseguire il recupero degli ovociti

  1. Contrassegna le etichette con nome, data e ID sui piatti e sui tubi della cultura.
  2. Posizionare il paziente nella posizione di litotomia della vescica; disinfettare costantemente, drappeggiare e strofinare la vagina con soluzione salina calda.
  3. Posizionare la sonda ad ultrasuoni all'interno della vagina; scansionare e registrare il numero di follicoli in entrambe le ovaie. Trova la posizione più vicina all'ovaio come sito di puntura ed evita l'intestino, la vescica e i grandi vasi sanguigni.
  4. Aspirare il liquido follicolare.
    1. Lavare l'ago con un mezzo di manipolazione stabile al pH prima di forare (vedere Tabella dei materiali).
    2. Iniettare l'ago di aspirazione da 19 G a singolo lume nelle ovaie sotto la guida degli ultrasuoni.
    3. Perforare follicoli più grandi con confini chiari più vicini alla sonda. In posizione bassa, iniettare rapidamente la soluzione di risciacquo integrata con 25 U/mL di eparina. Aspirare il liquido follicolare con l'ago sotto una pressione di 80-90 mmHg, ruotando leggermente l'ago per aspirare il più possibile il liquido follicolare. Perforare altri follicoli dal lato vicino a quello lontano su questo piano.
      NOTA: Durante l'aspirazione, il liquido follicolare contenente ovociti fluirà in una provetta sterile da 10 ml a pressione negativa. L'eparina può ridurre la viscosità del fluido follicolare per facilitare il processo di aspirazione.
    4. Rimuovere l'ago dall'ovaio (tenere l'ago nella parete vaginale). Regolare la direzione della sonda ad ultrasuoni e perforare i follicoli rimanenti su altri piani. Prova ad aspirare tutti i follicoli con un diametro di ~ 5-9 mm.
      NOTA: Regolare la posizione della sonda per mantenerla sempre più vicina alle ovaie. Premere il fornice vaginale con la forza appropriata per ridurre lesioni e sanguinamento.
    5. Estrarre l'ago dopo aver finito in un'ovaia, lavare l'ago con il mezzo di manipolazione e perforare l'altro lato con lo stesso metodo.
      NOTA: Aspirazione completa del follicolo entro 25-30 min.
  5. Trasferire il fluido follicolare dalla sala operatoria al laboratorio di fecondazione in vitro entro pochi minuti dalla conferma del nome e dell'ID del paziente.
    NOTA: Trasferire il liquido follicolare aspirato al banco di laboratorio IVF il prima possibile per prevenire la coagulazione.
  6. Rileva l'emorragia attiva nella cavità pelvica con l'ecografia B-mode dopo aver perforato tutti i follicoli. Inserire uno speculum e puntare la punta verso il fornice posteriore per rilevare il sanguinamento attivo nel sito di puntura.
    NOTA: Nessun sanguinamento attivo deve essere osservato nel sito di puntura vaginale se la posizione ovaia è normale e il recupero degli ovociti viene eseguito con attenzione. Per un leggero sanguinamento che continua anche dopo la compressione, tenere una garza sterile comprimere nella vagina per 2-4 ore. Controllare il sanguinamento eccessivo da piccole arterie utilizzando morsetti con pinza vascolare per 2-4 ore. Il sanguinamento nella cavità pelvica o nell'ovaio, che accade raramente, dovrebbe essere controllato mediante elettrocoagulazione mediante chirurgia laparoscopica.

6. Chirurgia ginecologica

  1. In base alle esigenze e alle condizioni del paziente, eseguire un intervento chirurgico ginecologico appropriato dopo il recupero degli ovociti.
    1. Eseguire un intervento chirurgico di perforazione ovarica laparoscopica per pazienti con sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) con resistenza al clomifene.
    2. Eseguire chirurgia ginecologica benigna per pazienti infertili prima del trattamento ART, come miomectomia isteroscopica, polipectomia, resezione transcervicale del setto e chirurgia tubarica laparoscopica e ovariocistectomia.
    3. Eseguire l'ovariectomia per la crioconservazione della fertilità di pazienti con cancro o malattia ematologica che necessitano di ricevere chemioradioterapia.
      NOTA: Questi interventi chirurgici ginecologici sono operazioni cliniche di base e standardizzate. Le linee guida operative in vari paesi e ospedali dovrebbero essere relativamente simili.

7. Eseguire IVM

NOTA: Eseguire l'intero processo di IVM su un piano omotermico a 37 °C.

  1. Filtrare il fluido follicolare aspirato con un filtro a cellule di nylon da 70 μm. Risciacquare ripetutamente il tubo di coltura e il filtro con un mezzo di manipolazione preriscaldato stabile al pH. Assicurarsi che tutti i COC immaturi siano completamente trasferiti al piatto di coltura. Raccogliere il fluido filtrato, risciacquare e coltura in una capsula di Petri da 100 x 15 mm.
  2. Esaminare i COC (Figura 2) sotto lo stereoscopio con ingrandimento 40x. Trasferire rapidamente gli immaturi in un mezzo ovocitario IVM preriscaldato.
    NOTA: scegliere un ingrandimento appropriato in base all'abitudine dell'operatore.
  3. Registrare il numero di COC immaturi coltivati.
  4. Informare il paziente sul numero di COC coltivati. Discutere la raccolta di sperma con i pazienti e i loro partner. Eseguire l'estrazione dello sperma secondo la normale procedura.
  5. Coltura i COC immaturi a 37 °C in aria umidificata contenente il 5% di CO2 e il 5% di O2 per 28-32 ore.
  6. Valutare la maturità degli ovociti.
    1. Denudere le cellule del cumulo mediante pipettaggio ripetuto utilizzando una pipetta Pasteur di vetro sotto lo stereoscopio con ingrandimento 40x. Esaminare l'estrusione del corpo polare (PB) per identificare lo stadio di sviluppo degli ovociti. Vedere la Figura 2 per immagini rappresentative di ovociti in COC, metafase II (MII), metafase I (MI) e vescicole germinali (GV) con chiare caratteristiche morfologiche.
      NOTA: Utilizzare una fiamma verticale (ad esempio, di un bruciatore Bunsen) per regolare il diametro della pipetta Pasteur di vetro alle dimensioni di un ovocita.
    2. Conta gli ovociti MII e registra il numero.
    3. Scegli ovociti maturi per la fecondazione in vitro o la vitrificazione.
      NOTA: Raccogliere lo sperma il giorno in cui gli ovociti maturano per la fecondazione in vitro, ma non per la vitrificazione degli ovociti.
    4. Coltura gli ovociti immaturi nello stadio GV e MI nel terreno di coltura IVM originale con cellule cumuliformi per altre 10-14 ore. Ripetere i passaggi 7.6.2-7.6.3.

8. Eseguire ICSI o vitrificazione degli ovociti

  1. Seguire la procedura standard del centro riproduttivo8.

9. Coltura di embrioni ed esecuzione della crioconservazione degli embrioni

  1. Seguire la procedura standard del centro riproduttivo8.

Risultati

Fino a dicembre 2019, OP-IVM è stato utilizzato per la conservazione della fertilità di 274 pazienti. Gli esiti embriologici e riproduttivi di 158 pazienti tra il 2014 e il 2016 sono stati pubblicati in un precedente articolo8. L'esempio seguente illustra la procedura seguita per un paziente PCOS che riceve OP-IVM nel 2016. Il paziente è un 28enne con diagnosi di infertilità primaria, cisti annessiale sinistra e PCOS. Ha ricevuto cistectomia laparoscopica e OP-...

Discussione

Il metodo OP-IVM descritto in questo articolo si estende alle applicazioni IVM convenzionali e combina L'IVM dopo il recupero degli ovociti con la chirurgia ginecologica di routine. Gli ovociti che sarebbero stati persi nella chirurgia ginecologica possono ora essere utilizzati per IVF-ET o FP senza ulteriori rischi chirurgici. OP-IVM è stato utilizzato per la prima volta per recuperare gli ovociti prima della perforazione ovarica nelle pazienti con PCOS. La sua applicazione si è presto estesa ai pazienti infertili che...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del China National Key R&D Program (n. 2017YFC1002000, 2018YFC1004001, 2019YFA0801400), della National Science Foundation of China (n. 81571386, 81730038), del CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-001) e dello Special Research Project of Chinese Capital Health Development (2018-2-4095).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
19 G single-lumen aspiration needlesCook, AustraliaK-OPS-7035-REH-ET
4-well plateCorning
70 μm nylon cell strainerFalcon, USA352350
CO2 IncubatorThermo
Culture oilVitrolife, Sweden10029,OVOIL Step 3.2.
FSH & LHFerring Reproductive Health, GermanyMENOPUR®
Glass Pasteur pipetteHilgenberg GmbH, Germany3154102-26
G-MOPS mediumpH-stable handling medium for washing the needle before puncturing
IVM mediumOrigio, DenmarkART-1600-B
Laminar Flow Clean BenchesESCO
Petri dishThermo Fisher Scientific, Denmark263991
pH stable handing media designed to support the handling and manipulation of oocytes and embryos outside the incubatorVitrolife, Sweden10130, G-MOPS PLUSStep 7.1.
Rinse solutionCook, AustraliaK-SIFB-100
StereoscopeNikon

Riferimenti

  1. Ho, V. N. A., Braam, S. C., Pham, T. D., Mol, B. W., Vuong, L. N. The effectiveness and safety of in vitro maturation of oocytes versus in vitro fertilization in women with a high antral follicle count. Human Reproduction. 34 (6), 1055-1064 (2019).
  2. Yang, Z. Y., Chian, R. C. Development of in vitro maturation techniques for clinical applications. Fertility and Sterility. 108 (4), 577-584 (2017).
  3. Hatirnaz, S., et al. Oocyte in vitro maturation: A sytematic review. Turkish Journal of Obstetrics and Gynecology. 15 (2), 112-125 (2018).
  4. Gremeau, A. S., et al. In vitro maturation or in vitro fertilization for women with polycystic ovaries? A case-control study of 194 treatment cycles. Fertility and Sterility. 98 (2), 355-360 (2012).
  5. Ho, V. N. A., Braam, S. C., Pham, T. D., Mol, B. W., Vuong, L. N. The effectiveness and safety of in vitro maturation of oocytes versus in vitro fertilization in women with a high antral follicle count. Human Reproduction. 34 (6), 1055-1064 (2019).
  6. Sahin, C., et al. Which should be the preferred technique during laparoscopic ovarian cystectomy. Reproductive Sciences. 24 (3), 393-399 (2017).
  7. Xiao, J., et al. Impact of hemostatic methods on ovarian reserve and fertility in laparoscopic ovarian cystectomy. Experimental and Therapeutic. 17 (4), 2689-2693 (2019).
  8. Song, X. -. L., et al. Enhancing the scope of in vitro maturation for fertility preservation: transvaginal retrieval of immature oocytes during endoscopic gynaecological procedures. Human Reproduction. 35 (4), 837-846 (2020).
  9. Magnusson, &. #. 1. 9. 7. ;., Källen, K., Thurin-Kjellberg, A., Bergh, C. The number of oocytes retrieved during IVF: a balance between efficacy and safety. Human Reproduction. 33 (1), 58-64 (2018).
  10. Larose, H., et al., Wellik, D. M., et al. Gametogenesis: A journey from inception to conception. Current Topics in Developmental Biology. 132, 257-310 (2019).
  11. Broer, S. L., Broekmans, F. J. M., Laven, J. S. E., Fauser, B. C. J. M. Anti-Müllerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications. Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).
  12. Arce, J. C., La Marca, A., Mirner Klein, B., Nyboe Andersen, A., Fleming, R. Antimüllerian hormone in gonadotropin releasing-hormone antagonist cycles: prediction of ovarian response and cumulative treatment outcome in good-prognosis patients. Fertility and Sterility. 99 (6), 1644-1653 (2013).
  13. Katayama, K. P., et al. Ultrasound-guided transvaginal needle aspiration of follicles for in vitro fertilization. Obstetrics and Gynecology. 72 (2), 271-274 (1988).
  14. Dellenbach, P., et al. Transvaginal sonographically controlled follicle puncture for oocyte retrieval. Fertility and Sterility. 44 (5), 656-662 (1985).
  15. Hirata, T., et al. Concomitant ovarian drilling and oocyte retrieval by laparoendoscopic single-site surgery led to live birth using in vitro maturation of oocyte and transfer of frozen-thawed blastocyst in woman with polycystic ovary syndrome. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 40 (5), 1431-1435 (2014).
  16. Deutinger, J., et al. Follicular aspiration for in vitro fertilization: sonographically guided transvaginal versus laparoscopic approach. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 26 (2), 127-133 (1987).
  17. Tanbo, T., Henriksen, T., Magnus, O., Abyholm, T. Oocyte retrieval in an IVF program. A comparison of laparoscopic and transvaginal ultrasound-guided follicular puncture. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 67 (3), 243-246 (1988).
  18. Nagy, Z. P., et al. Pregnancy and birth after intracytoplasmic sperm injection of in vitro matured germinal-vesicle stage oocytes: case report. Fertility and Sterility. 65 (5), 1047-1050 (1996).
  19. Söderström-Anttila, V., Mäkinen, S., Tuuri, T., Suikkari, A. -. M. Favourable pregnancy results with insemination of in vitro matured oocytes from unstimulated patients. Human Reproduction. 20 (6), 1534-1540 (2005).
  20. Hwang, J. L., Lin, Y. H., Tsai, Y. L. In vitro maturation and fertilization of immature oocytes: a comparative study of fertilization techniques. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 17 (1), 39-43 (2000).
  21. Walls, M., Junk, S., Ryan, J. P., Hart, R. IVF versus ICSI for the fertilization of in-vitro matured human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 25 (6), 603-607 (2012).
  22. Park, J. H., Jee, B. C., Kim, S. H. Comparison of normal and abnormal fertilization of in vitro-matured human oocyte according to insemination method. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 42 (4), 417-421 (2016).
  23. Ho, V. N. A., Pham, T. D., Le, A. H., Ho, T. M., Vuong, L. N. Live birth rate after human chorionic gonadotropin priming in vitro maturation in women with polycystic ovary syndrome. Journal of Ovarian Research. 11 (1), 70 (2018).
  24. Zheng, X., et al. Effect of hCG priming on embryonic development of immature oocytes collected from unstimulated women with polycystic ovarian syndrome. Reproductive Biology and Endocrinology. 10, 40 (2012).
  25. Tannus, S., et al. Predictive factors for live birth after in vitro maturation of oocytes in women with polycystic ovary syndrome. Archives of Gynecology and Obstetrics. 297 (1), 199-204 (2018).
  26. Cohen, Y., et al. Decreased pregnancy and live birth rates after vitrification of in vitro matured oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 35 (9), 1683-1689 (2018).
  27. Yazdanpanah, F., Khalili, M. A., Eftekhar, M., Karimi, H. The effect of vitrification on maturation and viability capacities of immature human oocytes. Archives of Gynecology and Obstetrics. 288 (2), 439-444 (2013).

Erratum


Formal Correction: Erratum: OP-IVM: Combining In vitro Maturation after Oocyte Retrieval with Gynecological Surgery
Posted by JoVE Editors on 6/26/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: OP-IVM: Combining In vitro Maturation after Oocyte Retrieval with Gynecological Surgery. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2 of the Protocol was updated from:

Add 0.5 mL of IVM medium supplemented with 0.075 IU/mL of follicle-stimulating hormone (FSH) and 0.075 IU/mL of luteinizing hormone (LH) to each well of a 4-well plate. Cover the medium with oil.

to:

Add 0.5 mL of IVM medium supplemented with 0.75 IU/mL of follicle-stimulating hormone (FSH) and 0.75 IU/mL of luteinizing hormone (LH) to each well of a 4-well plate. Cover the medium with oil.

The legend for Figure 2 was updated from:

Figure 2: Morphological characteristics of representative images of oocytes. (A) COCs, (B) MII, (C) MI, (D) GV stage. Abbreviations: COCs = cumulus-oocyte complexes; GV = germinal vesicle; MI = metaphase I; MII = metaphase II.

to:

Figure 2: Morphological characteristics of representative images of oocytes. (A) COCs, (B) GV, (C) MI, (D) MII stage. Abbreviations: COCs = cumulus-oocyte complexes; GV = germinal vesicle; MI = metaphase I; MII = metaphase II.

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

MedicinaNumero 171IVMconservazione della fertilitrecupero transvaginaleprocedure ginecologiche endoscopichePCOS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati