由瞬态双边常见胡萝卜动脉闭塞引起的缺血性视网膜损伤的 Murine 模型

摘要

在这里，我们描述了一个鼠标模型的视网膜缺血通过瞬态的双边常见的胡萝卜动脉闭塞使用简单的缝合线和夹子。该模型可用于了解心血管异常引起的视网膜缺血的病理机制。

摘要

多种血管疾病，如糖尿病视网膜病变、视网膜静脉或动脉闭塞以及眼缺血综合征可导致视网膜缺血。为了研究视网膜缺血的病理机制，需要开发相关的实验模型。从解剖学上讲，主要的视网膜供血血管是眼动脉 （OpA）， OpA 起源于普通胡萝卜动脉 （CCA） 的内胡萝卜动脉。因此，CCA的中断可以有效地导致视网膜缺血。在这里，我们建立了视网膜缺血的鼠标模型，通过瞬态的双边常见胡萝卜素动脉闭塞（tBCCAO），用6-0丝缝合右CCA，并通过夹子暂时将左CCA遮挡2秒，并表明tBCCAO可以诱发急性视网膜缺血，导致视网膜功能障碍。目前的方法通过仅使用手术针头和夹子来减少对手术器械的依赖，缩短了闭塞时间，以尽量减少意外的动物死亡，这在中脑动脉闭塞小鼠模型中经常看到，并保持常见视网膜缺血结果的可重复性。该模型可用于研究小鼠缺血视网膜病变的病理生理学，并进一步用于体内药物筛选。

引言

视网膜是一种神经感官组织，用于视觉功能。由于视觉功能需要大量的氧气，视网膜被称为身体中对氧气要求最高的组织之一^。由于氧气通过血管输送，网膜易患血管疾病。各种血管疾病，如糖尿病视网膜病变和视网膜血管（静脉或动脉）闭塞，可诱发视网膜缺血。为了研究视网膜缺血的病理机制，认为有必要对视网膜缺血进行可重复和临床相关的实验模型。通过插入内脏丝进行中脑动脉闭塞（MCAO）是开发实验性脑缺血^2、3体内啮齿动物模型的最普遍方法。由于眼动脉（OpA）接近MCA，MCAO模型也同时用于了解视网膜缺血的病理生理学^4，5，6。为了诱导脑缺血和视网膜缺血，长丝通常通过普通胡萝卜动脉 （CCA） 或外部胡萝卜动脉 （ECA） 的切口插入。这些方法很难执行，需要很长时间才能完成手术（一只小鼠超过60分钟），并导致手术后结果的高变异性^7。制定更好的模式以改善这些关切仍然很重要。

在这项研究中，我们只是使用短的瞬态双边CCA闭塞（tBCCAO）与针头和夹子诱导视网膜缺血在小鼠，并分析了视网膜缺血损伤的典型结果。在此视频中，我们将演示 tBCCAO 程序。

研究方案

这里描述的所有方法都得到了庆应大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 准备手术器械和动物

1. 高压外科手术器械，并保持他们在70%的乙醇。在每一次新的外科手术之前，清洁手术器械小心使用70%的乙醇。
2. 在特定无病原体 （SPF） 室中准备雄性 BALB/cAJc1 小鼠（6 周大，26-28 公斤），以便在手术前、手术期间和手术后保持无菌状态。

2. 瞬态双边常见胡萝卜动脉闭塞（tBCCAO）

1. 通过腹内注射将鼠标置于麻醉下，结合中佐兰（40微克/100微升）、梅德托米丁（7.5微克/100微升）和丁醇酸酸盐（50微克/100微升），称为"MMB"，如前述^的8，9。抓住老鼠的后皮，防止老鼠撞到眼睛，直到老鼠完全麻醉。
   1. 判断麻醉的深度，捏鼠标脚趾，直到它没有反应，其中的方法通常用于检查完整的麻醉^10。
      注:一般来说，小鼠入睡需要不到5分钟。适当的全身麻醉配方可能因机构而异。
2. 将一滴0.1%纯化的透明质钠眼药水溶液涂抹在眼睛上，防止麻醉下眼睛干燥。
3. 将鼠标放在它的背上，用胶带固定鼠标的爪子。
4. 手术前使用70%的乙醇对老鼠的颈部区域进行消毒。
   注:毛皮的额外剪裁没有进行，因为这可能导致随后的皮肤炎症^11，12。
5. 用刀片（图1）对颈部进行下垂切口。
   注:切口需要在颈部、胸骨和气管之间的中线进行。
6. 使用两个钳子小心地分离两个唾液腺，并动员它们来可视化潜在的CPA。
7. 在不损害其结构的情况下，小心地将右 CCA 与各自的血管神经和伴随的静脉隔离，并将两根 6-0 丝绸缝合线置于 CCA 下。将两条领带紧紧地系住，以阻止血流（图1）。
   注:在手术过程中，小静脉可能会受损。如果看到出血，需要擦拭才能清楚地显示CCA。
8. 从各自的血管神经和伴随的静脉中仔细查找左CCA，而不会伤害其结构，并通过夹子将左CCA遮挡 2 秒（图 1）。
   注:需要将 6-0 丝缝针放在左 CCA 下，以标记夹紧的部位。
9. 左CCA重新打开后，用6-0丝缝合颈部的缝合伤口，并在颈部涂抹抗生素（50 μL），以抑制细菌感染。
   注:在左CCA重新打开时，请轻轻取下夹子以避免损坏动脉壁。
10. 将0.75毫克/千克盐酸阿提帕米佐尔注射到鼠体内，帮助小鼠迅速从深度麻醉中恢复过来。将鼠标返回带预热垫的鼠标笼中。
    注意:不要让鼠标无人看管，直到鼠标恢复足够的意识，以保持体面休养。
11. 将 0.4 毫克/千克的布托帕诺酸酸注射到鼠标上，用于管理鼠标醒来时的疼痛。
    注:协议可在此处暂停。作为成功tBCCAO的第一个提示，可以观察到鼠标的眼睑下垂（图2）。
12. 对于安乐死，向小鼠注射3倍的MB混合物，并牺牲它们进行实验。

3. 一般观察（存活率和眼睑下垂）

1. 手术后，检查所有死因的存活率在第0天（手术后），1，3和7。
2. 评估眼睑下垂 4 点评级尺度: 1 = 无下垂， 2 = 轻度下垂 （约 50%）， 3 = 严重下垂 （超过 50%）， 4 = 眼睛放电严重下垂。

4. 视网膜输血

1. 注射200μL的FITC-dextran（25毫克/mL）到小鼠的左心室，这是通常用于观察血液灌注小鼠视网膜血管^13，14。
2. 循环后2分钟，将眼睛核化，固定在4%的准甲醛中1小时。视网膜被仔细获得和平装，如先前描述的^15，并通过荧光显微镜检查。
3. 以 4 倍的放大倍率拍摄视网膜整个坐骑的照片，并使用合并分析仪合并成一个单个，以前描述的^16。
4. 通过 NIH 斐济/ImageJ 软件中的容器分析工具测量注入区域。

5. 西方污点

1. 3和6小时后，tBCCAO，获得小鼠的眼睛，并立即转移到含有冷PBS的培养皿，以隔离视网膜。
2. 视网膜隔离后，进行西印，如先前描述的^9。
3. 与抗体一起孵化，用于缺氧诱发因子-1+（HIF-1+;一般缺氧标记）和β-Actin（内部负荷控制），然后孵化HRP结合的次要抗体。通过化学发光可视化信号。

6. 定量 PCR （qPCR）

1. 6，12和24小时后tBCCAO，处理获得的视网膜qPCR，如先前描述^的17。
2. 通过实时PCR系统执行qPCR。所使用的底漆列在 表 1中。通过ΔΔC_T 方法计算不同成绩单水平之间的折叠变化。

7. 免疫化学（IHC）

1. 3天后tBCCAO，获得小鼠的眼睛，并嵌入石蜡。
2. 用微切除术切割石蜡嵌入的眼睛，以获得眼部。
3. 去石蜡和染色眼睛部分的5μm厚度，如先前描述^的13。
4. 与胶质纤维酸性蛋白（GFAP;星形细胞和网膜中的穆勒细胞的可靠标记）的抗体一起孵化过夜，然后孵化亚历克萨氟555结合二次抗体。
5. 使用DAPI（4+，6-迪亚米迪诺-2-苯丙酮）染色视网膜中的细胞核。通过荧光显微镜可视化信号。
6. 按 4 分评级等级评估形态评分，如之前描述的 13、18:0 = 无信号、1 = 在胶质细胞层 （GCL） 中很少有正胶质端脚、2 = 从 GCL 到外核层 （ONL） 的标记过程很少，以及从 GCL 到 ONL 的大多数标记过程。

8. 电视网膜成像（ERG）

1. 3和7天后tBCCAO，执行ERG使用甘兹费尔德圆顶，采集系统和LED刺激器，如前所述^9。
2. 经过一夜的黑暗适应后，在昏暗的红灯下用MB组合麻醉小鼠。
3. 使用0.5%热带酰胺和0.5%苯肾上腺素的混合溶液来延长瞳孔。
4. 将活动电极放在隐形眼镜上，并将参考电极放置在口腔中。
5. 从每只动物的两只眼睛获得ERG响应。
6. 用各种刺激记录黑暗适应下的滑板反应。
7. 测量波从基线到波的最低点的振幅。
8. 测量 b 波的振幅，从波的最低点到 b 波的峰值。
9. 使用热垫在手术过程中保持所有小鼠的温暖。

9. 光学连贯断层扫描 （OCT）

1. tBCCAO后2周，使用SD-OCT系统执行OCT，如先前报道的^8，9。
2. 在测量中，通过0.5%的热带酰胺和0.5%的苯肾上腺素的混合溶液，让小鼠患上甲虫病，并通过MB的混合物进行全身麻醉。
3. 从赤道片的面对面扫描中获取 B 扫描图像。
4. 检查视网膜在0.2，0.4和0.6毫米从视神经头。
5. 测量视网膜厚度从视网膜神经纤维层 （NFL） 到外部限制膜 （ELM），并将测量值的平均值视为单个鼠标的视网膜厚度。
6. 将结果绘制为蜘蛛图。

结果

在FITC-dextran系统循环2分钟后，检查了假手术小鼠和tBCCAO手术小鼠左视网膜和右视网膜的视网膜血管（补充图1）。FITC-dextran在假手术小鼠的视网膜和tBCCAO操作的小鼠的左视网膜中完全可见，而在tBCCAO操作的小鼠的右视网膜中部分可检测到。

在tBCCAO之后，对眼睑下垂进行了检查（图2）。右眼显示温和（得分2;75%）和严重的眼睑（分数3和4:25%）?...

讨论

在这项研究中，我们已经表明，tBCCAO，使用简单的缝合和夹子，可以诱导视网膜缺血和伴随视网膜功能障碍。此外，我们已证明，我们目前的协议，开发视网膜缺血小鼠模型是更容易和更快相比，其他以前的协议，开发视网膜缺血损伤模型^2，3，7。

从解剖学上讲，左右脑动脉可以通过后沟通动脉（PCAs）连...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atipamezole hydrochloride	Zenoaq	Antisedan	For anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 Fast	Applied Biosystems	-	For qPCR
Butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	Vetorphale	For anesthesia
BZ-II Analyzer	KEYENCE	-	For an image merge
BALB/cAJc1	CLEA	-	Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAb	CST	3700	For western blot
Clamp Forcep	World Precision Instruments	WPI 500451	For surgery
Dumont forceps #5	Fine Science Tools	11251-10	For surgery
DAPI solution	Dojindo	340-07971	For IHC
Envisu SD-OCT system	Leica	R4310	For OCT
FITC-dextran	Merk	FD2000S	For retinal blood perfusion
Fluorescence microscope	KEYENCE	BZ-9000	For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrate	Senju Pharmaceutical	Gachifuro	For anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10)	Thermo	13-0300	For IHC
Heating pad	Marukan	RH-200	For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAb	CST	36169	For western blot
ImageQuant LAS 4000 mini	GE Healthcare	-	For chemiluminescence
Midazolam	Sandoz K.K	SANDOZ	For anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6	Sakura	-	For sectioning
Medetomidine	Orion Corporation	Domitor	For anesthesia
Needle holder	Handaya	HS-2307	For surgery
PuREC	MAYO Corporation	-	For ERG
Scissor	Fine Science Tools	91460-11	For surgery
Sodium hyaluronate	Santen Pharmaceutical	Hyalein	For eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochloride	Santen Pharmaceutical	Mydrin-P	For mydriasis
6-0 silk suture	Natsume	E12-60N2	For surgery