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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, descriviamo un modello di topo di ischemia retinica mediante occlusione bilaterale transitoria comune dell'arteria carotide usando suture semplici e un morsetto. Questo modello può essere utile per comprendere i meccanismi patologici dell'ischemia retinica causati da anomalie cardiovascolari.

Abstract

Diverse malattie vascolari come la retinopatia diabetica, l'occlusione delle vene o delle arterie retiniche e la sindrome ischemica oculare possono portare all'ischemia retinica. Per studiare i meccanismi patologici dell'ischemia retinica, è necessario sviluppare modelli sperimentali pertinenti. Anatomicamente, un principale vaso di alimentazione del sangue retinica è l'arteria oftalmica (OpA) e OpA ha origine dall'arteria carotide interna della comune arteria carotide (CCA). Pertanto, l'interruzione del CCA potrebbe effettivamente causare ischemia retinica. Qui, abbiamo stabilito un modello di topo di ischemia retinica mediante occlusione dell'arteria carotide comune bilaterale transitoria (tBCCAO) per legare il CCA destro con suture di seta 6-0 e per occludere il CCA sinistro transitoriamente per 2 secondi tramite un morsetto, e abbiamo dimostrato che tBCCAO potrebbe indurre ischemia retinica acuta che porta alla disfunzione retinica. L'attuale metodo riduce la dipendenza dagli strumenti chirurgici utilizzando solo aghi chirurgici e un morsetto, riduce i tempi di occlusione per ridurre al minimo la morte animale inaspettata, che è spesso vista nei modelli di topo dell'occlusione dell'arteria cerebrale media e mantiene la riproducibilità dei comuni risultati ischemici retinali. Il modello può essere utilizzato per studiare la fisiopatologia delle retinopatie ischemiche nei topi e ulteriormente può essere utilizzato per lo screening in vivo dei farmaci.

Introduzione

La retina è un tessuto neurosensoriale per la funzione visiva. Poiché è necessaria una notevole quantità di ossigeno per la funzione visiva, la retina è conosciuta come uno dei tessuti più esigenti di ossigeno nel corpo1. La retina è suscettibile alle malattie vascolari poiché l'ossigeno viene fornito attraverso i vasi sanguigni. Vari tipi di malattie vascolari, come la retinopatia diabetica e il vaso sanguigno retinale (vene o arterie) occlusione, possono indurre ischemia retinica. Per studiare i meccanismi patologici dell'ischemia retinica, sono considerati necessari modelli sperimentali riproducibili e clinicamente rilevanti di ischemia retinica. L'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) mediante inserimento di un filamento intraluminale è il metodo più generalmente utilizzato per lo sviluppo di modelli di roditori in vivo di ischemia cerebrale sperimentale2,3. A causa della vicinanza dell'arteria oftalmica (OpA) a MCA, i modelli MCAO vengono utilizzati anche contemporaneamente per comprendere la fisiopatologia dell'ischemia retinica4,5,6. Per indurre l'ischemia cerebrale insieme all'ischemia retinica, i filamenti lunghi vengono tipicamente inseriti attraverso l'incisione della comune arteria carotide (CCA) o dell'arteria carotide esterna (ECA). Questi metodi sono difficili da eseguire, richiedono molto tempo per completare l'intervento chirurgico (oltre 60 minuti per un topo) e portano ad alte variabilità nei risultati dopo l'interventochirurgico 7. Resta importante sviluppare un modello migliore per migliorare tali preoccupazioni.

In questo studio, abbiamo semplicemente usato breve occlusione bilaterale CCA transitoria (tBCCAO) con aghi e un morsetto per indurre l'ischemia retinica nei topi e analizzato i risultati tipici delle lesioni ischemiche nella retina. In questo video, daremo una dimostrazione della procedura tBCCAO.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Keio University School of Medicine.

1. Preparazione di strumenti chirurgici e animali

  1. Autoclave strumenti chirurgici e tenerli in 70% alcol etilico. Prima di ogni nuova procedura chirurgica, pulire accuratamente gli strumenti chirurgici utilizzando il 70% di alcol etilico.
  2. Preparare topi BALB/cAJc1 maschi (6 settimane, 26-28 kg) in una stanza priva di agenti patogeni specifici (SPF) per mantenere condizioni sterili prima, durante e dopo l'intervento chirurgico.

2. Occlusione dell'arteria carotide comune bilaterale transitoria (tBCCAO)

  1. Mettere un topo in anestesia mediante iniezione intraperitoneale con una combinazione di midazolam (40 μg/100 μL), medetomidina (7,5 μg/100 μL) e tartrato butorfannolo (50 μg/100 μL), detto "MMB", come descritto in precedenza8,9. Tenere le skin della schiena del mouse per evitare che il mouse sbatta gli occhi fino a quando il mouse non viene completamente anestetizzato.
    1. Giudicare la profondità dell'anestesia pizzicando la dita del mouse fino a quando non ha risposta, di cui il metodo viene comunemente utilizzato per controllare l'anestesia completa10.
      NOTA: Generalmente, sono necessari meno di 5 minuti affinché i topi si addormentino. Le ricette corrette per l'anestesia generale possono essere diverse dalle istituzioni.
  2. Applicare una goccia di soluzione di caduta oculare ialuronato di sodio purificata allo 0,1% sugli occhi per prevenire la secchezza degli occhi in anestesia.
  3. Posizionare il mouse sulla schiena e fissare le zampe del mouse utilizzando nastri adesivi.
  4. Disinfettare l'area del collo del mouse usando il 70% di alcol etilico prima dell'intervento chirurgico.
    NOTA: Il ritaglio aggiuntivo della pelliccia non è stato eseguito in quanto ciò può causare successivainfiammazione della pelle 11,12.
  5. Eseguire l'incisione sagittale del collo con una lama (Figura 1).
    NOTA: L'incisione deve essere effettuata sulla linea mediana tra collo, sterno e trachea.
  6. Separare attentamente entrambe le ghiandole salivari usando due forcep e mobilitarle per visualizzare le CTA sottostanti.
  7. Isolare attentamente il CCA destro dai rispettivi nervi vagali e dalle vene di accompagnamento senza danneggiare le loro strutture e posizionare due suture di seta 6-0 sotto il CCA. Legare saldamente le due cravatte per bloccare il flusso sanguigno (Figura 1).
    NOTA: Durante la procedura, piccole vene potrebbero essere danneggiate. Se si vede sanguinamento, è necessario pulire per visualizzare chiaramente i CCA.
  8. Trovare il CCA sinistro con attenzione dai rispettivi nervi vagali e dalle vene di accompagnamento senza danneggiare le loro strutture e occludere il CCA sinistro per 2 secondi da un morsetto (Figura 1).
    NOTA: È necessario posizionare un ago da sutura di seta 6-0 sotto il CCA sinistro per contrassegnare un sito per il bloccaggio.
  9. Dopo la riapertura del CCA sinistro, le ferite da sutura del collo da una sutura di seta 6-0 e applicare un tampone di antibiotico (50 μL) sul collo per inibire l'infezione batterica.
    NOTA: Rimuovere dolcemente un morsetto per evitare di danneggiare la parete arteriosa durante la riapertura del CCA sinistro.
  10. Iniettare 0,75 mg/kg di atipamezolo cloridrato per via intraperitoneale al topo per aiutare il topo a recuperare rapidamente dall'anestesia profonda. Riportare il mouse in una gabbia per topi con cuscinetti preriscaldati.
    NOTA: Non lasciare il mouse lasciato incustodito fino a quando il mouse non riacquista sufficiente coscienza per mantenere la reclinanza sternale.
  11. Iniettare 0,4 mg/kg di tartrato di butorfanolo al topo per la gestione del dolore quando il topo si sveglia.
    NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Come primo suggerimento per il successo del tBCCAO, si può osservare lo sbavatura delle palpebre del topo (Figura 2).
  12. Per l'eutanasia, iniettare 3 volte di miscela di MMB ai topi e sacrificarli per esperimenti.

3. Osservazioni generali (tassi di sopravvivenza e sbavatura palpebrali)

  1. Dopo l'intervento chirurgico, controllare i tassi di sopravvivenza per tutte le cause di morte al giorno 0 (dopo l'intervento chirurgico), 1, 3 e 7.
  2. Valutare lo sbavatura delle palpebre con una scala di valutazione di 4 punti: 1 = nessun cadente, 2 = lieve sbavatura (~50%), 3 = grave sbavatura (oltre il 50%) e 4 = grave sbavatura con scarica oculare.

4. Perfusione di sangue retinica

  1. Iniettare 200 μL di FITC-dextran (25 mg/mL) nel ventricolo sinistro del topo, che è comunemente usato per l'osservazione della perfusione di sangue nei vasi retinici deltopo 13,14.
  2. 2 minuti dopo la circolazione, enucleare gli occhi e fissare in paraformaldeide al 4% per 1 ora. Le retine sono state accuratamente ottenute e montate in piano, come descrittoin precedenza 15, ed esaminate tramite un microscopio a fluorescenza.
  3. Scattare fotografie dei supporti integrali retini con ingrandimento 4x e unirsi in un unico utilizzando un analizzatore di unione, descritto in precedenza16.
  4. Misurare le aree perfuse tramite uno strumento di analisi delle navi nel software NIH Fiji/ImageJ.

5. Macchia occidentale

  1. 3 e 6 ore dopo il tBCCAO, ottenere gli occhi dei topi e trasferire immediatamente in una piastra di Petri contenente PBS freddo per isolare le retine.
  2. Dopo l'isolamento delle retine, eseguire l'assorbimento occidentale, come descritto in precedenza9.
  3. Incubare con anticorpi per fattore ipossia-inducibile-1α (HIF-1α; un marcatore di ipossia generale) e per β-Actin (un controllo interno del carico) durante la notte seguito dall'incubazione di anticorpi secondari coniugati con HRP. Visualizza i segnali tramite chemiluminescenza.

6. PCR quantitativo (qPCR)

  1. 6, 12 e 24 ore dopo tBCCAO, elaborare le retine ottenute per qPCR, come descritto in precedenza17.
  2. Eseguire qPCR tramite sistema PCR in tempo reale. I primer utilizzati sono elencati nella tabella 1. Calcola le variazioni di piegatura tra i livelli di trascrizioni diverse con il metodo ΔΔCT.

7. Immunoistochimica (IHC)

  1. 3 giorni dopo tBCCAO, ottenere gli occhi dei topi e incorporare in paraffina.
  2. Tagliare gli occhi incorporati nella paraffina con un microtomo per ottenere le sezioni oculari.
  3. De-paraffinare e macchiare le sezioni oculari di 5 μm di spessore come descritto in precedenza13.
  4. Incubare con un anticorpo per la proteina acida fibrillare gliale (GFAP; un marcatore affidabile per astrociti e cellule di Müller nella retina) durante la notte seguito dall'incubazione di anticorpi secondari coniugati con Alexa Fluor 555.
  5. Utilizzare DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo) per macchiare il nucleo nella retina. Visualizza i segnali tramite un microscopio a fluorescenza.
  6. Valutare il punteggio morfologico in base a una scala di valutazione di 4 punti, come descritto inprecedenza 13,18: 0 = nessun segnale, 1 = pochi piedi finali gliali positivi nello strato di cellule gangliari (GCL), 2 = pochi processi etichettati che vanno dal GCL allo strato nucleare esterno (ONL) e 3 = processi più etichettati che vanno da GCL a ONL.

8. Elettroretinografia (ERG)

  1. 3 e 7 giorni dopo tBCCAO, eseguire ERG utilizzando una cupola di Ganzfeld, un sistema di acquisizione e stimolatori LED, come descritto in precedenza9.
  2. Dopo l'adattamento scuro durante la notte, anestetizza i topi con una combinazione di MMB sotto la luce rossa fioca.
  3. Utilizzare una soluzione mista dello 0,5% di tropicamide e dello 0,5% di fenilefrina per dilatare le pupille.
  4. Posizionare gli elettrodi attivi sulla lente a contatto e posizionare l'elettrodo di riferimento in bocca.
  5. Ottenere risposte ERG da entrambi gli occhi di ogni animale.
  6. Registra le risposte scotopiche sotto l'adattamento oscuro con vari stimoli.
  7. Misurare le ampiezze di un'onda dalla linea di base al punto più basso di un'onda.
  8. Misurare le ampiezze dell'onda b dal punto più basso di un'onda al picco dell'onda b.
  9. Tenere tutti i topi al caldo durante la procedura utilizzando termoscapacchi.

9. Tomografia a coerenza ottica (PTOM)

  1. 2 settimane dopo tBCCAO, eseguire lo Strumento di personalizzazione di Office utilizzando il sistema SD-OCT, comeprecedentemente riportato 8,9.
  2. Per la misurazione, sottoscrivi i topi alla mioriasi con una soluzione mista dello 0,5% di tropicamide e 0,5% di fenilefrina e all'anestesia generale da una miscela di MMB.
  3. Ottenere immagini di scansione B da fette equatoriali di scansioni en-face.
  4. Esaminare le retine a 0,2, 0,4 e 0,6 mm dalla testa del nervo ottico.
  5. Misurare lo spessore retinico dallo strato di fibra nervosa retinica (NFL) alla membrana limitante esterna (ELM), e considerare la media dei valori misurati come spessore retinico di un singolo topo.
  6. Traccia i risultati come diagrammi a ragno.

Risultati

Dopo la circolazione sistemica del FITC-dextran per 2 minuti, sono state esaminate le vasculure retiniche delle retine sinistra e destra nei topi azionati da sham e nei topi azionati da tBCCAO (Figura complementare 1). Fitc-dextran era completamente visibile sia nelle retine nei topi a farsa che nella retina sinistra nei topi azionati da tBCCAO, mentre era parzialmente rilevabile nella retina destra nei topi azionati da tBCCAO.

Dopo il tBCCAO, è stato esaminato lo sbavatura d...

Discussione

Nello studio, abbiamo dimostrato che il tBCCAO, utilizzando suture semplici e un morsetto, potrebbe indurre ischemia retinica e conseguente disfunzione retinica. Inoltre, abbiamo dimostrato che il nostro attuale protocollo per lo sviluppo di un modello di topo di ischemia retinica è più facile e veloce rispetto ad altri protocolli precedenti per lo sviluppo di modelli di lesioni ischemiche retiniche2,3,7.

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (18K09424 a Toshihide Kurihara e 20K18393 a Yukihiro Miwa) del Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia (MEXT).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Atipamezole hydrochlorideZenoaqAntisedanFor anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 FastApplied Biosystems-For qPCR
Butorphanol tartrateMeiji Seika PharmaVetorphaleFor anesthesia
BZ-II AnalyzerKEYENCE-For an image merge
BALB/cAJc1CLEA-Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAbCST3700For western blot
Clamp ForcepWorld Precision InstrumentsWPI 500451For surgery
Dumont forceps #5Fine Science Tools11251-10For surgery
DAPI solutionDojindo340-07971For IHC
Envisu SD-OCT systemLeicaR4310For OCT
FITC-dextranMerkFD2000SFor retinal blood perfusion
Fluorescence microscopeKEYENCEBZ-9000For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrateSenju PharmaceuticalGachifuroFor anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10)Thermo13-0300For IHC
Heating padMarukanRH-200For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAbCST36169For western blot
ImageQuant LAS 4000 miniGE Healthcare-For chemiluminescence
MidazolamSandoz K.KSANDOZFor anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6Sakura-For sectioning
MedetomidineOrion CorporationDomitorFor anesthesia
Needle holderHandayaHS-2307For surgery
PuRECMAYO Corporation-For ERG
ScissorFine Science Tools91460-11For surgery
Sodium hyaluronateSanten PharmaceuticalHyaleinFor eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochlorideSanten PharmaceuticalMydrin-PFor mydriasis
6-0 silk sutureNatsumeE12-60N2For surgery

Riferimenti

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