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Resumo

Aqui, descrevemos um modelo de camundongo de isquemia de retina por oclusão da artéria carótida comum bilateral transitória usando suturas simples e um grampo. Este modelo pode ser útil para entender os mecanismos patológicos da isquemia da retina causada por anormalidades cardiovasculares.

Resumo

Diversas doenças vasculares, como retinopatia diabética, oclusão de veias da retina ou artérias e síndrome isquêmica ocular podem levar à isquemia da retina. Para investigar mecanismos patológicos da isquemia da retina, são necessários desenvolver modelos experimentais relevantes. Anatomicamente, um dos principais vasos de abastecimento sanguíneo da retina é a artéria oftalmômica (OpA) e a OpA é originária da artéria carótida interna da artéria carótida comum (CCA). Assim, a interrupção da CCA poderia efetivamente causar isquemia retinista. Aqui, estabelecemos um modelo de camundongo de isquemia de retina por oclusão da artéria carótida comum transitória (tBCCAO) para amarrar a CCA direita com suturas de seda 6-0 e ocluir a CCA esquerda transitoriamente por 2 segundos através de um grampo, e mostrou que o tBCCAO poderia induzir isquemia aguda de retina levando à disfunção da retina. O método atual reduz a dependência de instrumentos cirúrgicos usando apenas agulhas cirúrgicas e um grampo, encurta o tempo de oclusão para minimizar a morte inesperada de animais, o que é frequentemente visto em modelos de camundongos de oclusão da artéria cerebral média, e mantém a reprodutibilidade de achados isquêmicos comuns da retina. O modelo pode ser utilizado para investigar a fisiopatologia de retinopatias isquêmicas em camundongos e ainda pode ser usado para triagem in vivo de medicamentos.

Introdução

A retina é um tecido neurossensorial para função visual. Uma vez que uma quantidade substancial de oxigênio é necessária para a função visual, a retina é conhecida como um dos tecidos mais exigentes de oxigênio no corpo1. A retina é suscetível a doenças vasculares, pois o oxigênio é entregue através dos vasos sanguíneos. Vários tipos de doenças vasculares, como a retinopatia diabética e a oclusão dos vasos sanguíneos da retina (veias ou artérias), podem induzir isquemia da retina. Para investigar mecanismos patológicos de isquemia da retina, são considerados necessários modelos experimentais reprodutíveis e clinicamente relevantes de isquemia de retina. A oclusão da artéria cerebral média (MCAO) por inserção de um filamento intraluminal é o método mais utilizado para o desenvolvimento de modelos de roedores in vivo de isquemia cerebral experimental2,3. Devido à proximidade da artéria oftalmológica (OpA) com a MCA, os modelos de MCAO também são utilizados simultaneamente para entender a fisiopatologia da isquemia da retina4,5,6. Para induzir isquemia cerebral junto com isquemia de retina, filamentos longos são tipicamente inseridos através da incisão da artéria carótida comum (CCA) ou da artéria carótida externa (ECA). Esses métodos são difíceis de realizar, requerem muito tempo para completar a cirurgia (mais de 60 minutos para um rato), e levam a altas variabilidades nos desfechos após a cirurgia7. É importante desenvolver um modelo melhor para melhorar essas preocupações.

Neste estudo, bastamos usar a oclusão bilateral de CCA transitória curta (tBCCAO) com agulhas e um grampo para induzir isquemia de retina em camundongos e analisamos resultados típicos de lesões isquêmicas na retina. Neste vídeo, vamos dar uma demonstração do procedimento tBCCAO.

Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Escola de Medicina da Universidade keio.

1. Preparação de instrumentos cirúrgicos e animais

  1. Autoclave instrumentos cirúrgicos e mantê-los em 70% de álcool etílico. Antes de cada novo procedimento cirúrgico, limpe os instrumentos cirúrgicos cuidadosamente utilizando 70% de álcool etílico.
  2. Prepare camundongos BALB/cAJc1 machos (6 semanas de idade, 26-28 kg) em uma sala específica-livre de patógenos (SPF) para manter condições estéreis antes, durante e depois da cirurgia.

2. Oclusão da artéria carótida comum bilateral transitória (tBCCAO)

  1. Coloque um rato sob anestesia por injeção intraperitoneal com uma combinação de midazolam (40 μg/100 μL), medetomidina (7,5 μg/100 μL) e tartarato butorphanol (50 μg/100 μL), denominado "MMB", como descrito anteriormente8,9. Segure as peles traseiras do mouse para manter o rato longe de bater os olhos até que o rato esteja completamente anestesiado.
    1. Julgue a profundidade da anestesia beliscando o dedo do mouse até que ele não tenha resposta, do qual o método é comumente usado para verificar anestesia completa10.
      NOTA: Geralmente, menos de 5 min são necessários para que os ratos durmam. Receitas adequadas para anestesia geral podem ser diferentes pelas instituições.
  2. Aplique uma gota de 0,1% purificada solução de olírio de hialuronato de sódio aos olhos para evitar o ressecamento nos olhos sob anestesia.
  3. Coloque o mouse de costas e conserte as patas do mouse usando fitas adesivas.
  4. Desinfete a área do pescoço do rato usando 70% de álcool etílico antes da cirurgia.
    NOTA: O recorte adicional da pele não foi realizado, pois isso pode causar inflamação posterior da pele11,12.
  5. Realizar incisão sagital do pescoço com uma lâmina(Figura 1).
    NOTA: A incisão precisa ser feita na linha média entre o pescoço, esterno e traqueia.
  6. Separe as duas glândulas salivares cuidadosamente usando dois fórceps e mobilize-as para visualizar os CCAs subjacentes.
  7. Isole a CCA direita cuidadosamente dos respectivos nervos vagos e veias que acompanham sem prejudicar suas estruturas, e coloque duas suturas de seda 6-0 sob a CCA. Amarre os dois laços firmemente para bloquear o fluxo sanguíneo(Figura 1).
    NOTA: Durante o procedimento, pequenas veias podem ser danificadas. Se o sangramento for visto, é necessário limpar os CCAs claramente.
  8. Encontre a CCA esquerda cuidadosamente a partir dos respectivos nervos vagos e veias que acompanham sem prejudicar suas estruturas, e oclua a CCA esquerda por 2 segundos por um grampo(Figura 1).
    NOTA: É necessário colocar uma agulha de sutura de seda 6-0 sob a CCA esquerda para marcar um local para fixação.
  9. Após a reabertura da CCA esquerda, sutura feridas do pescoço por uma sutura de seda 6-0 e aplicam um pouco de antibiótico (50 μL) no pescoço para inibir infecção bacteriana.
    NOTA: Remova suavemente um grampo para evitar danificar a parede arterial ao reabrir a CCA esquerda.
  10. Injete 0,75 mg/kg de cloridrato de atipamezole intraperitoneally no camundongo para ajudar o rato a se recuperar de anestesia profunda rapidamente. Devolva o mouse para uma gaiola de rato com almofadas pré-aquecidas.
    NOTA: Não deixe o rato sair sozinho até que o rato recupere a consciência suficiente para manter a recumbência severa.
  11. Injete 0,4 mg/kg de tartarato butorphanol no mouse para o manejo da dor quando o rato acordar.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Como primeira dica para o sucesso do tBCCAO, pode-se observar a inclinação das pálpebras do mouse(Figura 2).
  12. Para eutanásia, injete 3x de mistura de MMB nos camundongos e sacrifique-os para experimentos.

3. Observações gerais (taxas de sobrevivência e inclinação das pálpebras)

  1. Após a cirurgia, verifique as taxas de sobrevivência de todas as causas de morte no dia 0 (após a cirurgia), 1, 3 e 7.
  2. Avalie a inclinação das pálpebras por uma escala de classificação de 4 pontos: 1 = sem inclinação, 2 = inclinação leve (~50%), 3 = inclinação severa (acima de 50%) e 4 = inclinação severa com descarga ocular.

4. Perfusão sanguínea retinana

  1. Injete 200 μL de FITC-dextran (25 mg/mL) no ventrículo esquerdo do camundongo, que é comumente usado para a observação da perfusão sanguínea nos vasos de retina do rato13,14.
  2. 2 minutos após a circulação, enuclear os olhos e fixar em 4% paraformaldeído por 1 hora. As retinas foram cuidadosamente obtidas e montadas planas, como descrito anteriormente15, e examinadas através de um microscópio de fluorescência.
  3. Tire fotos das montagens inteiras da retina em 4x de ampliação e mescle em um único usando um analisador de mesclagem, descrito anteriormente16.
  4. Meça as áreas perfundidas através de uma ferramenta de análise de embarcações no software NIH Fiji/ImageJ.

5. Mancha ocidental

  1. 3 e 6 horas após tBCCAO, obtenha os olhos dos ratos e transfira imediatamente para uma placa de Petri contendo PBS frio para isolar as retinas.
  2. Após o isolamento das retinas, realize manchas ocidentais, como descrito anteriormente9.
  3. Incubar com anticorpos para fator indutível de hipóxia-1α (HIF-1α; um marcador geral de hipóxia) e para β-Actin (um controle de carregamento interno) durante a noite seguido da incubação de anticorpos secundários conjugados pelo HRP. Visualize os sinais via chemiluminescência.

6. PCR quantitativo (qPCR)

  1. 6, 12 e 24 horas após tBCCAO, processe as retinas obtidas para qPCR, como descrito anteriormente17.
  2. Execute qPCR via sistema PCR em tempo real. Os primers utilizados estão listados na Tabela 1. Calcule as alterações de dobra entre os níveis de diferentes transcrições pelo método ΔΔCT.

7. Imunohistoquímica (IHC)

  1. 3 dias após tBCCAO, obtenha os olhos de ratos e incorpore em parafina.
  2. Corte os olhos embutidos na parafina por um microtome para obter as seções oculares.
  3. Desparafinar e manchar as seções oculares de 5 μm de espessura como descrito anteriormente13.
  4. Incubar com um anticorpo para proteína ácida fibrilar gliana (GFAP; um marcador confiável para astrócitos e células Müller na retina) durante a noite seguido pela incubação do anticorpo secundário Alexa Fluor 555-conjugado.
  5. Use DAPI (4′,6-diamidino-2-fenildole) para coloração do núcleo na retina. Visualize sinais através de um microscópio de fluorescência.
  6. Avalie a pontuação da morfologia por uma escala de classificação de 4 pontos, como descrito anteriormente13,18: 0 = sem sinal, 1 = poucos pés finais gliais positivos na camada de célula de gânglio (GCL), 2 = poucos processos rotulados que atingem de GCL à camada nuclear externa (ONL) e 3 = a maioria dos processos rotulados que atingem de GCL para ONL.

8. Eletroretinografia (ERG)

  1. 3 e 7 dias após a tBCCAO, realize o ERG utilizando uma cúpula ganzfeld, sistema de aquisição e estimuladores led, como descrito anteriormente9.
  2. Após adaptação escura da noite para o dia, anestesia os ratos com uma combinação de MMB sob luz vermelha fraca.
  3. Use uma solução mista de 0,5% de trópico e 0,5% de fenilefrina para dilatar as pupilas.
  4. Coloque os eletrodos ativos na lente de contato e coloque o eletrodo de referência na boca.
  5. Obtenha respostas de ERG de ambos os olhos de cada animal.
  6. Registos scotopic registro sob adaptação escura com vários estímulos.
  7. Meça as amplitudes de uma onda da linha de base até o ponto mais baixo de uma onda.
  8. Meça as amplitudes da onda B do ponto mais baixo de uma onda até o pico da onda B.
  9. Mantenha todos os ratos aquecidos durante o procedimento usando almofadas de calor.

9. Tomografia de coerência óptica (OCT)

  1. 2 semanas após tBCCAO, realize o OCT usando o sistema SD-OCT, como relatado anteriormente8,9.
  2. Para a medição, sujeitos camundongos à micrária por uma solução mista de 0,5% de tropamida e 0,5% fenilefrina, e à anestesia geral por uma mistura de MMB.
  3. Obtenha imagens de varredura B de fatias equatoriais de varreduras en-face.
  4. Examine as retinas a 0,2, 0,4 e 0,6 mm da cabeça do nervo óptico.
  5. Meça a espessura da retina da camada de fibra nervosa da retina (NFL) até a membrana limitante externa (ELM), e considere a média dos valores medidos como espessura da retina de um camundongo individual.
  6. Plote os resultados como diagramas de aranha.

Resultados

Após a circulação sistêmica do FITC-dextran por 2 minutos, foram examinadas vasculaturas de retina das retinas esquerda e direita nos camundongos operados por sham e camundongos operados por tBCCAO(Figura Suplementar 1). FITC-dextran era totalmente visível nas duas retinas nos camundongos operados por farsa e na retina esquerda nos camundongos operados por tBCCAO, enquanto era parcialmente detectável na retina direita nos camundongos operados por tBCCAO.

Após tBCCAO, fo...

Discussão

No estudo, mostramos que o tBCCAO, utilizando suturas simples e um grampo, poderia induzir isquemia de retina e disfunção retinista. Além disso, demonstramos que nosso protocolo atual para o desenvolvimento de um modelo de camundongo de isquemia de retina é mais fácil e rápido em comparação com outros protocolos anteriores para o desenvolvimento de modelos de lesão isquêmica de retina2,3,7.

...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (18K09424 para Toshihide Kurihara e 20K18393 para Yukihiro Miwa) do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia (MEXT).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Atipamezole hydrochlorideZenoaqAntisedanFor anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 FastApplied Biosystems-For qPCR
Butorphanol tartrateMeiji Seika PharmaVetorphaleFor anesthesia
BZ-II AnalyzerKEYENCE-For an image merge
BALB/cAJc1CLEA-Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAbCST3700For western blot
Clamp ForcepWorld Precision InstrumentsWPI 500451For surgery
Dumont forceps #5Fine Science Tools11251-10For surgery
DAPI solutionDojindo340-07971For IHC
Envisu SD-OCT systemLeicaR4310For OCT
FITC-dextranMerkFD2000SFor retinal blood perfusion
Fluorescence microscopeKEYENCEBZ-9000For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrateSenju PharmaceuticalGachifuroFor anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10)Thermo13-0300For IHC
Heating padMarukanRH-200For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAbCST36169For western blot
ImageQuant LAS 4000 miniGE Healthcare-For chemiluminescence
MidazolamSandoz K.KSANDOZFor anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6Sakura-For sectioning
MedetomidineOrion CorporationDomitorFor anesthesia
Needle holderHandayaHS-2307For surgery
PuRECMAYO Corporation-For ERG
ScissorFine Science Tools91460-11For surgery
Sodium hyaluronateSanten PharmaceuticalHyaleinFor eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochlorideSanten PharmaceuticalMydrin-PFor mydriasis
6-0 silk sutureNatsumeE12-60N2For surgery

Referências

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