Un modèle murin des dommages rétiniens ischémiques induits par occlusion commune transitoire d’artère carotide

Résumé

Ici, nous décrivons un modèle de souris de l’ischémie rétinienne par occlusion commune transitoire d’artère carotide utilisant des sutures simples et une pince. Ce modèle peut être utile pour comprendre les mécanismes pathologiques de l’ischémie rétinienne provoquées par des anomalies cardio-vasculaires.

Résumé

Diverses maladies vasculaires telles que la rétinopathie diabétique, l’occlusion des veines rétiniennes ou des artères et le syndrome ischémique oculaire peuvent mener à l’ischémie rétinienne. Pour étudier les mécanismes pathologiques de l’ischémie rétinienne, des modèles expérimentaux pertinents doivent être développés. Anatomiquement, un vaisseau principal d’approvisionnement en sang rétinien est l’artère ophtalmique (OpA) et opa provient de l’artère carotide interne de l’artère carotide commune (CCA). Ainsi, la perturbation de la CCA pourrait effectivement causer l’ischémie rétinienne. Ici, nous avons établi un modèle de souris de l’ischémie rétinienne par occlusion commune transitoire d’artère carotide (tBCCAO) pour attacher le CCA droit avec des sutures de soie 6-0 et pour occluser le CCA gauche transitoirement pendant 2 secondes par l’intermédiaire d’une pince, et avons prouvé que tBCCAO pourrait induire l’ischémie rétinienne aiguë menant au dysfonctionnement rétinien. La méthode actuelle réduit la dépendance aux instruments chirurgicaux en utilisant seulement des aiguilles chirurgicales et une pince, raccourcit le temps d’occlusion pour réduire au minimum la mort animale inattendue, qui est souvent vue dans les modèles de souris de l’occlusion cérébrale moyenne d’artère, et maintient la reproductibilité des résultats ischémiques rétiniens communs. Le modèle peut être utilisé pour étudier la pathophysiologie des rétinopathies ischémiques chez la souris et peut être utilisé pour le dépistage des médicaments in vivo.

Introduction

La rétine est un tissu neurosensoriel pour la fonction visuelle. Puisqu’une quantité substantielle d’oxygène est nécessaire pour la fonction visuelle, la rétine est connue comme l’un des tissus exigeants en oxygène les plus élevés dans le^{corps 1.} La rétine est sensible aux maladies vasculaires car l’oxygène est livré par les vaisseaux sanguins. Divers types de maladies vasculaires, telles que la rétinopathie diabétique et l’occlusion des vaisseaux sanguins rétiniens (veines ou artères), peuvent induire une ischémie rétinienne. Pour étudier les mécanismes pathologiques de l’ischémie rétinienne, des modèles expérimentaux reproductibles et cliniquement pertinents de l’ischémie rétinienne sont considérés comme nécessaires. Occlusion cérébrale moyenne d’artère (MCAO) par insertion d’un filament intraluminal est la méthode la plus généralement utilisée pour le développement des modèles in vivo de rongeur de l’ischémie cérébrale^{expérimentale 2,3}. En raison de la proximité de l’artère ophtalmique (OpA) au MCA, les modèles mcao sont également utilisés simultanément pour comprendre la pathophysiologie de l’ischémie rétinienne^4,5,6. Pour induire l’ischémie cérébrale avec l’ischémie rétinienne, de longs filaments sont typiquement insérés par incision de l’artère carotide commune (CCA) ou de l’artère carotide externe (ECA). Ces méthodes sont difficiles à exécuter, nécessitent beaucoup de temps pour terminer la chirurgie (plus de 60 minutes pour une souris), et conduisent à des variabilités élevées dans les résultats après la chirurgie⁷. Il reste important d’élaborer un meilleur modèle pour améliorer ces préoccupations.

Dans cette étude, nous avons simplement employé l’occlusion bilatérale transitoire courte de CCA (tBCCAO) avec des aiguilles et une pince pour induire l’ischémie rétinienne chez les souris et avons analysé des résultats typiques des dommages ischémiques dans la rétine. Dans cette vidéo, nous ferons une démonstration de la procédure tBCCAO.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Keio University School of Medicine.

1. Préparation d’instruments chirurgicaux et d’animaux

1. Autoclavez les instruments chirurgicaux et gardez-les dans 70% d’alcool éthylique. Avant chaque nouvelle intervention chirurgicale, nettoyez soigneusement les instruments chirurgicaux en utilisant 70 % d’alcool éthylique.
2. Préparer les souris BALB/cAJc1 mâles (6 semaines, 26-28 kg) dans une pièce exempte d’agents pathogènes spécifiques (FPS) afin de maintenir des conditions stériles avant, pendant et après la chirurgie.

2. Occlusion commune transitoire d’artère carotide commune (tBCCAO)

1. Mettez une souris sous anesthésie par injection intraperitoneal avec une combinaison de midazolam (40 μg/100 μL), de médetomidine (7,5 μg/100 μL) et de tartrate de butorphanol (50 μg/100 μL), appelé « MMB », comme^{décrit précédemment 8,9}. Tenez les peaux arrière de la souris pour empêcher la souris de se cogner les yeux jusqu’à ce que la souris soit complètement anesthésiée.
   1. Jugez la profondeur de l’anesthésie en pinçant l’ateil de la souris jusqu’à ce qu’il n’ait pas de réponse, dont la méthode est couramment utilisée pour vérifier l’anesthésie^{complète 10}.
      REMARQUE : En général, moins de 5 minutes sont nécessaires pour que les souris s’endorment. Les recettes appropriées pour l’anesthésie générale peuvent être différentes selon les institutions.
2. Appliquer une goutte de 0,1% purifié sodium hyaluronate solution goutte oculaire aux yeux pour prévenir la sécheresse sur les yeux sous anesthésie.
3. Placez la souris sur son dos et fixez les pattes de la souris à l’aide de rubans adhésifs.
4. Désinfecter la zone du cou de la souris à l’aide de 70% d’alcool éthylique avant la chirurgie.
   REMARQUE : La coupure addition supplémentaire de la fourrure n’a pas été exécutée car ceci peut causer l’inflammation suivante^{de peau 11,12.}
5. Effectuez une incision sagittale du cou à l’l’insu d’unelame ( figure 1).
   REMARQUE : L’incision doit être faite sur la ligne médiane entre le cou, le sternum et la trachée.
6. Séparez soigneusement les deux glandes salivaires à l’aide de deux forceps et mobilisez-les pour visualiser les AC sous-jacents.
7. Isolez soigneusement le CCA droit des nerfs vagal respectifs et des veines qui l’accompagnent sans nuire à leurs structures, et placez deux sutures de soie 6-0 sous le CCA. Attachez les deux liens étroitement pour bloquer le flux sanguin (Figure 1).
   REMARQUE : Pendant l’intervention, de petites veines pourraient être endommagées. Si des saignements sont observés, l’essuyage est nécessaire pour visualiser clairement les AC.
8. Trouvez soigneusement le CCA gauche des nerfs vagal respectifs et des veines qui l’accompagnent sans nuire à leurs structures, et occlusez le CCA gauche pendant 2 secondes par une pince (figure 1).
   REMARQUE : Une aiguille de suture en soie 6-0 doit être placée sous le CCA gauche pour marquer un emplacement pour le serrage.
9. Après la réouverture du CCA gauche, suture des plaies du cou par une suture de soie 6-0 et appliquer une touche d’antibiotique (50 μL) sur le cou pour inhiber l’infection bactérienne.
   REMARQUE : Retirez doucement une pince pour éviter d’endommager le mur artélial lors de la réouverture du CCA gauche.
10. Injectez 0,75 mg/kg d’hydrochlorure d’atipamezole intraperitoneally à la souris pour aider la souris récupérée de l’anesthésie profonde rapidement. Remettre la souris dans une cage à souris avec des coussinets préchauffés.
    REMARQUE : Ne laissez pas la souris laissée sans surveillance jusqu’à ce que la souris reprenne suffisamment conscience pour maintenir la récumbence sternale.
11. Injecter 0,4 mg/kg de tartrate de butorphanol à la souris pour la gestion de la douleur lorsque la souris se réveille.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Comme premier indice pour réussir tBCCAO, la paupière tombant de la souris peut être observée (Figure 2).
12. Pour l’euthanasie, injecter 3x de mélange MMB aux souris et les sacrifier pour des expériences.

3. Observations générales (taux de survie et tombant des paupières)

1. Après la chirurgie, vérifiez les taux de survie pour toutes les causes de décès au jour 0 (après la chirurgie), 1, 3 et 7.
2. Évaluer la limidation par une échelle de notation de 4 points : 1 = pas de tombant, 2 = tombant léger (~50%), 3 = tombant sévère (plus de 50%), et 4 = tombant sévère avec décharge d’oeil.

4. Perfusion de sang rétinien

1. Injecter 200 μL de FITC-dextran (25 mg/mL) dans le ventricule gauche de la souris, qui est couramment utilisé pour l’observation de la perfusion sanguine dans les vaisseaux rétiniens^{de la souris 13,14}.
2. 2 minutes après la circulation, enucleate les yeux et fixer dans 4% paraformaldéhyde pendant 1 heure. Les rétines ont été soigneusement obtenues et montées à plat, comme^{précédemment décrit 15,}et examinées par un microscope de fluorescence.
3. Prenez des photos des montures entières rétiniennes au grossissement 4x et fusionnez en un seul à l’aide d’un analyseur de fusion,^{précédemment décrit 16}.
4. Mesurer les zones perfusées à l’aide d’un outil d’analyse des navires dans le logiciel NIH Fiji/ImageJ.

5. Tache occidentale

1. 3 et 6 heures après tBCCAO, obtenir les yeux des souris et transférer immédiatement dans une boîte de Pétri contenant du PBS froid pour isoler les rétines.
2. Après l’isolement des rétines, effectuer des ballonnements occidentaux, comme précédemment^{décrit 9}.
3. Incuber avec des anticorps pour le facteur-1α hypoxia-inductible (HIF-1α; un marqueur général d’hypoxie) et pour β-Actin (un contrôle interne de chargement) pendant la nuit suivi de l’incubation des anticorps secondaires HRP-conjugués. Visualisez les signaux par chimioluminescence.

6. PCR quantitatif (QPCR)

1. 6, 12 et 24 heures après tBCCAO, traiter les rétines obtenues pour qPCR, comme précédemment^{décrit 17}.
2. Effectuez qPCR via le système PCR en temps réel. Les amorces utilisées sont énumérées dans le tableau 1. Calculer les changements de pli entre les niveaux de différentes transcriptions par la méthode ΔΔC_T.

7. Immunohistochimie (IHC)

1. 3 jours après tBCCAO, obtenir les yeux des souris et intégrer dans la paraffine.
2. Couper les yeux encastrés dans la paraffine par un microtome pour obtenir les sections des yeux.
3. Dé-paraffiniser et tacher les sections oculaires de 5 μm d’épaisseur comme décrit précédemment¹³.
4. Incuber avec un anticorps pour la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP; un marqueur fiable pour les astrocytes et les cellules Müller dans la rétine) pendant la nuit suivie de l’incubation de l’anticorps secondaire conjugué Alexa Fluor 555.
5. Utilisez DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) pour tacher le noyau dans la rétine. Visualisez les signaux au microscope à fluorescence.
6. Évaluer la notation morphologique par une échelle d’évaluation de 4 points, comme^{décrit précédemment 13,18}: 0 = aucun signal, 1 = peu de pieds finaux gliale positifs dans la couche de cellules ganglionnaires (GCL), 2 = peu de processus étiquetés atteignant de GCL à la couche nucléaire externe (ONL), et 3 = la plupart des processus étiquetés atteignant de GCL à ONL.

8. Électroréinographie (ERG)

1. 3 et 7 jours après tBCCAO, effectuez ERG à l’aide d’un dôme Ganzfeld, d’un système d’acquisition et de stimulateurs LED, comme^{décrit précédemment 9}.
2. Après une adaptation sombre du jour au lendemain, anesthésier les souris avec une combinaison de MMB sous une faible lumière rouge.
3. Utilisez une solution mixte de 0,5% de tropicamide et 0,5% de phényléphrine pour dilater les pupilles.
4. Placez les électrodes actives sur la lentille de contact et placez l’électrode de référence dans la bouche.
5. Obtenez des réponses ERG des deux yeux de chaque animal.
6. Enregistrez les réponses scotopiques sous adaptation sombre avec divers stimuli.
7. Mesurer les amplitudes d’une onde de la ligne de base au point le plus bas d’une onde.
8. Mesurer les amplitudes de l’onde B du point le plus bas d’une onde jusqu’au pic de b-wave.
9. Gardez toutes les souris au chaud pendant la procédure à l’aide de coussinets thermiques.

9. Tomographie par cohérence optique (OCT)

1. 2 semaines après tBCCAO, effectuer oct en utilisant le système SD-OCT, comme précédemment signalé^8,9.
2. Pour la mesure, soumettre les souris à la mydriase par une solution mixte de 0,5% de tropicamide et 0,5% de phényléphrine, et à l’anesthésie générale par un mélange de MMB.
3. Obtenez des images de balayage B à partir de tranches équatoriales de scans en face.
4. Examiner les rétines à 0,2, 0,4 et 0,6 mm de la tête du nerf optique.
5. Mesurez l’épaisseur rétinienne de la couche de fibres nerveuses rétiniennes (NFL) à la membrane limite externe (ELM), et considérez la moyenne des valeurs mesurées comme l’épaisseur rétinienne d’une souris individuelle.
6. Tracez les résultats sous forme de diagrammes d’araignées.

Résultats

Après la circulation systémique du FITC-dextran pendant 2 minutes, des vasculatures rétiniennes des rétines gauche et droite dans les souris sham-operated et les souris tBCCAO-actionnées ont été examinées(figure supplémentaire 1). Fitc-dextran était entièrement visible dans les deux rétines chez les souris opérées par imposture et la rétine gauche chez les souris opérées par tBCCAO, alors qu’elle était partiellement détectable dans la rétine droite chez les souris opérées par tBCC...

Discussion

Dans l’étude, nous avons montré que tBCCAO, utilisant des sutures simples et une pince, pourrait induire l’ischémie rétinienne et le dysfonctionnement rétinien qui l’accompagne. En outre, nous avons démontré notre protocole actuel pour le développement d’un modèle de souris de l’ischémie rétinienne est plus facile et plus rapide par rapport à d’autres protocoles précédents pour le développement de modèles de lésions ischémiques^{rétiniennes 2,}

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atipamezole hydrochloride	Zenoaq	Antisedan	For anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 Fast	Applied Biosystems	-	For qPCR
Butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	Vetorphale	For anesthesia
BZ-II Analyzer	KEYENCE	-	For an image merge
BALB/cAJc1	CLEA	-	Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAb	CST	3700	For western blot
Clamp Forcep	World Precision Instruments	WPI 500451	For surgery
Dumont forceps #5	Fine Science Tools	11251-10	For surgery
DAPI solution	Dojindo	340-07971	For IHC
Envisu SD-OCT system	Leica	R4310	For OCT
FITC-dextran	Merk	FD2000S	For retinal blood perfusion
Fluorescence microscope	KEYENCE	BZ-9000	For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrate	Senju Pharmaceutical	Gachifuro	For anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10)	Thermo	13-0300	For IHC
Heating pad	Marukan	RH-200	For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAb	CST	36169	For western blot
ImageQuant LAS 4000 mini	GE Healthcare	-	For chemiluminescence
Midazolam	Sandoz K.K	SANDOZ	For anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6	Sakura	-	For sectioning
Medetomidine	Orion Corporation	Domitor	For anesthesia
Needle holder	Handaya	HS-2307	For surgery
PuREC	MAYO Corporation	-	For ERG
Scissor	Fine Science Tools	91460-11	For surgery
Sodium hyaluronate	Santen Pharmaceutical	Hyalein	For eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochloride	Santen Pharmaceutical	Mydrin-P	For mydriasis
6-0 silk suture	Natsume	E12-60N2	For surgery