과도 양측 공통 경동맥 폐색에 의해 유도된 허혈성 망막 손상의 뮤린 모델

요약

여기서, 우리는 간단한 봉합사 및 클램프를 사용하여 일시적인 양측 공통 경동맥 폐색에 의한 망막 허혈의 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 심혈관 비정상으로 인한 망막 허혈의 병리학적 메커니즘을 이해하는 데 유용할 수 있습니다.

초록

당뇨병 성 망막병증, 망막 정맥 또는 동맥 및 안구 허혈 증후군의 폐색과 같은 다양한 혈관 질환은 망막 허혈으로 이어질 수 있습니다. 망막 허혈의 병리학 적 메커니즘을 조사하려면 관련 실험 모델을 개발해야합니다. 해부학적으로, 주요 망막 혈액 공급 혈관은 안과 동맥 (OpA) 및 OpA는 일반적인 경동맥의 내부 경동맥에서 유래 (CCA). 따라서 CCA의 중단은 망막 허혈을 효과적으로 유발할 수 있습니다. 여기서, 우리는 6-0 실크 봉합사를 가진 오른쪽 CCA를 묶고 클램프를 통해 2 초 동안 좌측 CCA를 폐색하기 위하여 일시적인 양측 공통 경동맥 폐색(tBCCAO)에 의하여 망막 허혈증의 마우스 모형을 설치하고, tBCCAO가 재발성 기능 장애로 선도하는 급성 망막증증을 유도할 수 있었다는 것을 보여주었습니다. 현재 방법은 수술 바늘과 클램프를 사용하여 수술 기구에 대한 의존도를 줄이고, 중간 뇌동맥 폐색의 마우스 모델에서 흔히 볼 수 있는 예기치 않은 동물 사망을 최소화하기 위해 폐색 시간을 단축하며, 일반적인 망막 허혈성 발견의 재현성을 유지합니다. 이 모델은 마우스의 허혈성 망막병증의 병리학을 조사하기 위해 활용될 수 있으며 생체 내 약물 스크리닝에 더 사용될 수 있다.

서문

망막은 시각 기능을 위한 신경 감각 조직입니다. 시각 기능에 상당한 양의 산소가 필요하기 때문에 망막은 신체^1에서가장 높은 산소 를 요구하는 조직 중 하나로 알려져 있습니다. 망막은 산소가 혈관을 통해 전달되기 때문에 혈관 질환에 취약합니다. 당뇨병 성 망막병증 및 망막 혈관 (정맥 또는 동맥) 폐색과 같은 다양한 유형의 혈관 질환은 망막 허혈을 유발할 수 있습니다. 망막 허혈의 병리학적 메커니즘을 조사하기 위해, 망막 허혈의 재현 가능하고 임상적으로 관련된 실험 모델은 필요하다고 간주됩니다. 중간 대뇌 동맥 폐색(MCAO)은 내트라루민 필라멘트의 삽입에 의한 실험대뇌 허혈^2,3의생체 내 설치류 모델의 개발을 위해 가장 일반적으로 활용되는 방법이다. MCA에 안과 동맥(OpA)의 근접성으로 인해 MCAO 모델은 망막 허혈^4,5,6의병리생리학을 이해하는 데 동시에 사용된다. 망막 허혈과 함께 대뇌 허혈을 유도하기 위해, 긴 필라멘트는 전형적으로 일반적인 경동맥 (CCA) 또는 외부 경동맥 (ECA)의 절개를 통해 삽입됩니다. 이러한 방법은 수행하기 어렵고, 수술을 완료하는 데 오랜 시간이 걸리며(한 마우스의 경우 60분 이상), 수술 후 결과에 높은 변이성을 초래할^{수 있다 7.} 이러한 문제를 개선하기 위해 더 나은 모델을 개발하는 것이 중요합니다.

이 연구에서는, 우리는 단순히 짧은 일시적인 양자 CCA 폐색 (tBCCAO)을 바늘과 클램프로 사용하여 쥐의 망막 허혈을 유도하고 망막에서 허혈성 부상의 전형적인 결과를 분석했습니다. 이 비디오에서는 tBCCAO 절차를 시연할 것입니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 게이오 대학 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 수술 기구 및 동물의 준비

1. 자동 클캐브 수술 기구와 70 % 에틸 알코올에 보관하십시오. 새로운 수술 전, 70% 에틸 알코올을 사용하여 수술 기구를 조심스럽게 청소하십시오.
2. 수술 전, 수술 중 및 수술 후 멸균 상태를 유지하기 위해 특정 병원균(SPF) 실에서 남성 BALB/cAJc1 마우스(6주 전, 26-28kg)를 준비한다.

2. 일시적인 양자 공통 경동맥 폐색 (tBCCAO)

1. 미다졸람(40 μg/100 μL), 메데토미딘(7.5 μg/100 μL) 및 부안소솔 타르테레이트(50 μg/100 μL)의 조합으로 관내 주사를 통해 마취하에 마우스를넣어^8,9. 마우스의 뒤쪽 스킨을 잡고 마우스가 완전히 마취될 때까지 마우스가 눈을 부딪히지 않도록 합니다.
   1. 응답이 없을 때까지 마우스 발가락을 꼬집어 마취의 깊이를 판단하며, 그 중 어떤 방법은 일반적으로 완전한^{마취(10)를}확인하는 데 사용됩니다.
      참고: 일반적으로 생쥐가 잠들기 위해서는 5분 미만이 필요합니다. 전신 마취를위한 적절한 조리법은 기관에 의해 다를 수 있습니다.
2. 마취 하에 눈의 건조를 방지하기 위해 피부에 0.1 % 정제 된 히알루네이트 안약 용액을 1 방울을 적용하십시오.
3. 마우스를 뒷면에 놓고 접착제 테이프를 사용하여 마우스의 발을 고정합니다.
4. 수술 전 70%의 에틸 알코올을 사용하여 마우스의 목 부위를 소독합니다.
   참고: 모피의 추가 클리핑은 후속 피부^{염증(11,12)을}유발할 수 있으므로 수행되지 않았다.
5. 칼날(도1)으로목의 처상 절개를 수행합니다.
   참고 : 절개는 목, 흉골 및 기관 사이의 중간선에서 만들어져야합니다.
6. 두 개의 집게를 사용하여 침샘을 조심스럽게 분리하고 이를 동원하여 기본 CCA를 시각화합니다.
7. 올바른 CCA를 각 진골 신경과 동반 정맥으로부터 조심스럽게 분리하고 구조물에 해를 끼치지 않고 CCA 아래에 6-0 실크 봉합사 2개를 배치합니다. 혈류를 차단하기 위해 두 넥타이를 단단히 묶습니다(도1).
   참고: 시술 중에 작은 정맥이 손상될 수 있습니다. 출혈이 보이는 경우 CCA를 명확하게 시각화하려면 닦아야 합니다.
8. 왼쪽 CCA를 각각의 진골 신경과 동반정맥으로부터 조심스럽게 찾아내고, 클램프(그림1)에의해 2초 동안 왼쪽 CCA를 폐포한다.
   참고: 클램핑 을 위한 사이트를 표시하기 위해 왼쪽 CCA 아래에 6-0 실크 봉합사 바늘을 배치해야 합니다.
9. 왼쪽 CCA의 재개 후, 6-0 실크 봉합사에 의해 목의 봉합상처와 세균 감염을 억제하기 위해 목에 항생제(50 μL)를 적용한다.
   참고: 왼쪽 CCA를 다시 열 때 동맥 벽이 손상되지 않도록 클램프를 부드럽게 제거합니다.
10. 마우스에 0.75 mg/kg의 아티파메졸 염산염을 마우스에 삽입하여 마우스가 깊은 마취에서 신속하게 회복할 수 있도록 돕습니다. 미리 가열 된 패드가있는 마우스 케이지에 마우스를 반환합니다.
    참고: 마우스가 흉골 의상환을 유지하기에 충분한 의식을 되찾을 때까지 마우스를 방치하지 마십시오.
11. 마우스가 깨어날 때 통증의 관리를 위해 마우스에 0.4 mg/kg의 부차톨타르트를 주입하십시오.
    참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 성공적인 tBCCAO에 대한 첫 번째 힌트로서 마우스의 눈꺼풀 처짐을 관찰할 수있습니다(그림 2).
12. 안락사의 경우, 마우스에 MMB 혼합물의 3x를 주입하고 실험을 위해 그들을 희생.

3. 일반적인 관찰 (생존율과 눈꺼풀 처진)

1. 수술 후, 0일째(수술 후), 1, 3, 7일의 모든 사망 원인에 대한 생존율을 확인한다.
2. 눈꺼풀을 4점 등급 척도로 평가합니다: 1 = 처진 없음, 2 = 가벼운 처진 (~50%), 3 = 심한 처진 (50%), 및 4 = 눈 배출이 심한 처진.

4. 망막 혈액 관류

1. FITC-dextran(25 mg/mL)을 마우스의 좌심실로 200 μL을 주입하며, 이는 일반적으로 마우스 망막^{혈관(13,14)의}혈액 관류 관찰에 일반적으로 사용된다.
2. 순환 후 2분 후, 눈을 방출하고 1 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 고정합니다. 망막은 이전에 설명된^15와같이 신중하게 얻어지고 평평하게 장착되었고, 형광 현미경을 통해 검사하였다.
3. 4배 배율로 망막 전체 마운트의 사진을 찍고 이전에 설명한^16개의병합 분석기를 사용하여 단일로 병합한다.
4. NIH 피지/ImageJ 소프트웨어의 선박 분석 도구를 통해 perfused 영역을 측정합니다.

5. 웨스턴 블롯

1. tBCCAO 후 3 시간 및 6 시간, 마우스의 눈을 얻고 즉시 망막을 분리하기 위해 차가운 PBS를 포함하는 페트리 접시로 전송.
2. 망막의 격리 후, 이전에 설명 된 바와 같이, 서쪽 블로팅을 수행^9.
3. 저산소유도인자-1α(HIF-1α; 일반 저산소증 마커)와 hrP-접합 이차 항체의 배양이 이어지는 β-액틴(내부 적재 제어)에 대한 항체를 배양한다. 화학 발광을 통해 신호를 시각화합니다.

6. 정량적 PCR (qPCR)

1. tBCCAO 후 6, 12 및 24시간 후, 이전에 설명된 바와 같이 qPCR에 대해 얻은 망막을^{처리한다.}
2. 실시간 PCR 시스템을 통해 qPCR을 수행합니다. 사용되는 프라이머는 표 1에나열됩니다. ΔΔC_T 메서드에 의해 서로 다른 전사체 수준 간의 접기 변화를 계산합니다.

7. 면역 화학 (IHC)

1. tBCCAO 후 3 일, 마우스의 눈을 얻고 파라핀에 포함.
2. 눈 섹션을 얻기 위해 마이크로 토메에 의해 파라핀 임베디드 눈을 잘라.
3. 앞서 설명한 바와 같이 5 μm 두께의 눈 단면을 분리하고^{염색하였다.}
4. 신경교 세동 산성 단백질 (GFAP; 망막에 있는 성상 세포 및 뮐러 세포를 위한 믿을 수 있는 마커)에 대한 항체와 함께 배양한 다음 알렉사 플루어 555-공주 이차 항체의 배양에 선행됩니다.
5. 망막에 핵을 염색하기 위해 DAPI (4′,6-디아미드노-2-페닐린돌)를 사용합니다. 형광 현미경을 통해 신호를 시각화합니다.
6. 이전에 설명한 바와 같이 4점 등급 척도로 형태 점수를 평가하였고,^13,18: 신호 없음, 1 = 신경절 세포 층(GCL)에서 몇 가지 양성 신경교 말발, 2 = GCL에서 외부 핵층(ONL)까지 도달하는 몇 가지 라벨이 붙은 공정, 그리고 3 = GCL에서 ONL로 도달하는 가장 라벨이 붙은 공정이 거의 없다.

8. 전기 전하 (ERG)

1. tBCCAO 후 3 및 7일 후, 이전에 설명한 바와 같이 간즈펠트 돔, 획득 시스템 및 LED 자극기를 사용하여 ERG를^{수행한다.}
2. 하룻밤 어두운 적응 에 따라, 희미한 붉은 빛 아래 MMB의 조합으로 마우스를 마취.
3. 0.5% 열대아미드와 0.5% 페닐레프린의 혼합 용액을 사용하여 동공을 넓힙시다.
4. 활성 전극을 콘택트 렌즈에 놓고 참조 전극을 입에 놓습니다.
5. 각 동물의 양눈에서 ERG 응답을 얻습니다.
6. 다양한 자극으로 어두운 적응하에 스쿠토피 응답을 기록합니다.
7. 기준선에서 가장 낮은 파도 지점까지 의 진폭을 측정합니다.
8. 파도의 가장 낮은 지점에서 b-wave의 피크까지 b-wave의 진폭을 측정합니다.
9. 열 패드를 사용하여 시술 중에 모든 마우스를 따뜻하게 유지하십시오.

9. 광학 일관성 단층 촬영 (10월)

1. tBCCAO 후 2 주, SD-OCT 시스템을 사용하여 OCT를 수행, 이전에보고 된 대로^8,9.
2. 측정을 위해, 피험자 마우스는 0.5% 열대성 및 0.5% 페닐레프린의 혼합 용액에 의한 mydriasis, 및 MMB의 혼합물에 의한 전신 마취에 의해.
3. en-face 스캔의 적도 조각에서 B 스캔 이미지를 가져옵니다.
4. 시신경 헤드에서 망막 0.2, 0.4 및 0.6 mm에서 망막을 검사하십시오.
5. 망막 신경 섬유 층(NFL)에서 외부 제한 막(ELM)으로 망막 두께를 측정하고 측정된 값의 평균을 개별 마우스의 망막 두께로 고려한다.
6. 결과를 거미 다이어그램으로 플롯합니다.

결과

FITC-dextran의 전신 순환 후 2분 동안, 가짜 작용 마우스 및 tBCCAO 수술 마우스에서 좌우 망막의 망막 혈관을 검사하였다(보충도 1). FITC-dextran은 tBCCAO 수술 마우스에서 샴 작동 마우스와 왼쪽 망막의 두 망막모두에서 완전히 보였으며 tBCCAO 수술 마우스의 오른쪽 망막에서 부분적으로 검출되었습니다.

tBCCAO 후, 눈꺼풀 처진 검사(그림 2). 오른쪽 눈...

토론

연구에서, 우리는 tBCCAO, 간단한 봉합사 및 클램프를 사용하여, 망막 허혈및 동반망막 기능 장애를 유도할 수 있었다는 것을 보여주었습니다. 더욱이, 망막 허혈의 마우스 모델 의 개발을 위한 현재 의정서가 망막 허혈성 상해 모델^2,3,7의개발을 위한 다른 이전 프로토콜과 비교하여 더 쉽고 빠르다는 것을^{입증했습니다.}

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atipamezole hydrochloride	Zenoaq	Antisedan	For anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 Fast	Applied Biosystems	-	For qPCR
Butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	Vetorphale	For anesthesia
BZ-II Analyzer	KEYENCE	-	For an image merge
BALB/cAJc1	CLEA	-	Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAb	CST	3700	For western blot
Clamp Forcep	World Precision Instruments	WPI 500451	For surgery
Dumont forceps #5	Fine Science Tools	11251-10	For surgery
DAPI solution	Dojindo	340-07971	For IHC
Envisu SD-OCT system	Leica	R4310	For OCT
FITC-dextran	Merk	FD2000S	For retinal blood perfusion
Fluorescence microscope	KEYENCE	BZ-9000	For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrate	Senju Pharmaceutical	Gachifuro	For anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10)	Thermo	13-0300	For IHC
Heating pad	Marukan	RH-200	For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAb	CST	36169	For western blot
ImageQuant LAS 4000 mini	GE Healthcare	-	For chemiluminescence
Midazolam	Sandoz K.K	SANDOZ	For anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6	Sakura	-	For sectioning
Medetomidine	Orion Corporation	Domitor	For anesthesia
Needle holder	Handaya	HS-2307	For surgery
PuREC	MAYO Corporation	-	For ERG
Scissor	Fine Science Tools	91460-11	For surgery
Sodium hyaluronate	Santen Pharmaceutical	Hyalein	For eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochloride	Santen Pharmaceutical	Mydrin-P	For mydriasis
6-0 silk suture	Natsume	E12-60N2	For surgery