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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Mausmodell der retinalen Ischämie durch vorübergehende bilaterale gemeinsame Karotisarterienverschluss mit einfachen Nähten und einer Klemme. Dieses Modell kann nützlich sein, um die pathologischen Mechanismen der retinalen Ischämie zu verstehen, die durch kardiovaskuläre Anomalien verursacht wird.

Zusammenfassung

Verschiedene Gefäßerkrankungen wie diabetische Retinopathie, Okklusion der Netzhautvenen oder Arterien und das okuläre ischämische Syndrom können zu retinaler Ischämie führen. Um pathologische Mechanismen der retinalen Ischämie zu untersuchen, müssen relevante experimentelle Modelle entwickelt werden. Anatomisch ist ein Haupt-Retinal-Blutversorgungsgefäß die ophthalmologische Arterie (OpA) und OpA stammt aus der inneren Halsschlagader der gemeinsamen Halsschlagader (CCA). So könnte eine Störung der CCA effektiv retinale Ischämie verursachen. Hier haben wir ein Mausmodell der retinalen Ischämie durch vorübergehende bilaterale gemeinsame Karotisarterienverschluss (tBCCAO) etabliert, um die rechte CCA mit 6-0 Seidennähten zu binden und die linke CCA vorübergehend für 2 Sekunden über eine Klemme zu verschließen, und zeigten, dass tBCCAO akute retinale Ischämie induzieren kann, die zu einer retinalen Dysfunktion führt. Die aktuelle Methode reduziert die Abhängigkeit von chirurgischen Instrumenten, indem sie nur chirurgische Nadeln und eine Klemme verwendet, verkürzt die Okklusionszeit, um unerwartete Tiersterben zu minimieren, was häufig in Mausmodellen der mittleren Zerebrierungsokklusion zu beobachten ist, und behält die Reproduzierbarkeit der häufigen retinalen ischämischen Befunde bei. Das Modell kann verwendet werden, um die Pathophysiologie der ischämischen Retinopathien bei Mäusen zu untersuchen und kann weiter für in vivo Drogenscreening verwendet werden.

Einleitung

Die Netzhaut ist ein neurosensorisches Gewebe für die visuelle Funktion. Da eine erhebliche Menge an Sauerstoff für die visuelle Funktion benötigt wird, ist die Netzhaut als eines der höchsten sauerstofffordernden Gewebe im Körperbekannt 1. Die Netzhaut ist anfällig für Gefäßerkrankungen, da Sauerstoff über die Blutgefäße abgegeben wird. Verschiedene Arten von Gefäßerkrankungen, wie diabetische Retinopathie und Netzhautblutgefäß (Venen oder Arterien) Okklusion, können netzhautische Ischämie induzieren. Zur Untersuchung pathologischer Mechanismen der retinalen Ischämie werden reproduzierbare und klinisch relevante experimentelle Modelle der retinalen Ischämie als notwendig erachtet. Die mittlere zerebrale Arterienverschluss (MCAO) durch Einsetzen eines intraluminalen Filaments ist die am häufigsten verwendete Methode zur Entwicklung von in vivo Nagetiermodellen der experimentellen zerebralen Ischämie2,3. Aufgrund der Nähe der ophthalmologischen Arterie (OpA) zu MCA werden MCAO-Modelle auch gleichzeitig verwendet, um die Pathophysiologie der Netzhautischämie4,5,6zu verstehen. Um zerebrale Ischämie zusammen mit retinaler Ischämie zu induzieren, werden lange Filamente in der Regel durch Inzision der gemeinsamen Halsschlagader (CCA) oder der äußeren Halsschlagader (ECA) eingesetzt. Diese Methoden sind schwierig durchzuführen, benötigen eine lange Zeit, um die Operation abzuschließen (über 60 Minuten für eine Maus), und führen zu hohen Variabilitäten in den Ergebnissen nach der Operation7. Es ist nach wie vor wichtig, ein besseres Modell zu entwickeln, um diese Bedenken zu verbessern.

In dieser Studie verwendeten wir einfach kurze transiente bilaterale CCA-Okklusion (tBCCAO) mit Nadeln und einer Klemme, um retinale Ischämie bei Mäusen zu induzieren und analysierten typische Ergebnisse ischämischer Verletzungen in der Netzhaut. In diesem Video werden wir eine Demonstration des tBCCAO-Verfahrens geben.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Keio University School of Medicine genehmigt.

1. Vorbereitung von chirurgischen Instrumenten und Tieren

  1. Autoklav chirurgische Instrumente und halten Sie sie in 70% Ethylalkohol. Reinigen Sie vor jedem neuen chirurgischen Eingriff chirurgische Instrumente sorgfältig mit 70% Ethylalkohol.
  2. Bereiten Sie männliche BALB/cAJc1-Mäuse (6 Wochen alt, 26-28 kg) in einem spezifisch pathogenfreien (SPF) Raum vor, um sterile Bedingungen vor, während und nach der Operation aufrechtzuerhalten.

2. Transiente bilaterale gemeinsame Karotisarterienverschluss (tBCCAO)

  1. Setzen Sie eine Maus unter Anästhesie durch intraperitoneale Injektion mit einer Kombination aus Midazolam (40 g/100 l), Medetomidin (7,5 g/100 l) und Butorphanoltartrat (50 g/100 l), wie zuvor beschrieben8,9. Halten Sie die Hinterhaut der Maus, um die Maus davon abzuhalten, ihre Augen zu stoßen, bis die Maus vollständig beästhebt ist.
    1. Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Maus Zehen kneifen, bis sie keine Antwort hat, von welcher Methode wird häufig für die Überprüfung der vollständigen Anästhesie10verwendet.
      HINWEIS: Im Allgemeinen sind weniger als 5 min erforderlich, damit Mäuse einschlafen können. Richtige Rezepte für die Vollnarkose können von Institutionen unterschiedlich sein.
  2. Tragen Sie einen Tropfen von 0,1% gereinigte Natriumhyaluronat Augentropfenlösung auf die Augen auf, um Trockenheit auf den Augen unter Anästhesie zu verhindern.
  3. Legen Sie die Maus auf den Rücken und fixieren Sie die Pfoten der Maus mit Klebebändern.
  4. Desinfizieren Sie den Halsbereich der Maus mit 70% Ethylalkohol vor der Operation.
    HINWEIS: ZusätzlicheS Abschneiden des Fells wurde nicht durchgeführt, da dies zu einer nachfolgenden Hautentzündung führen kann11,12.
  5. Führen Sie einen sagittalen Schnitt des Halses mit einer Klinge (Abbildung 1).
    HINWEIS: Der Schnitt muss an der Mittellinie zwischen Hals, Brustbein und Luftröhre erfolgen.
  6. Trennen Sie beide Speicheldrüsen sorgfältig mit zwei Zangen und mobilisieren Sie sie, um die zugrunde liegenden CCAs zu visualisieren.
  7. Isolieren Sie die richtige CCA sorgfältig von den jeweiligen vagalen Nerven und begleitenden Venen, ohne ihre Strukturen zu schädigen, und legen Sie zwei 6-0 Seidennähte unter die CCA. Binden Sie die beiden Krawatten fest, um den Blutfluss zu blockieren (Abbildung 1).
    HINWEIS: Während des Verfahrens können kleine Venen beschädigt werden. Wenn Blutungen auftreten, ist ein Wischen erforderlich, um die CCAs klar zu visualisieren.
  8. Finden Sie die linke CCA sorgfältig von den jeweiligen vagalen Nerven und begleitenden Venen, ohne ihre Strukturen zu beschädigen, und verschließen Sie die linke CCA für 2 Sekunden durch eine Klemme (Abbildung 1).
    HINWEIS: Eine 6-0 Seidennahtnadel muss unter dem linken CCA platziert werden, um eine Stelle zum Spannen zu markieren.
  9. Nach wiedererbrechen der linken CCA, Nähte des Halses durch eine 6-0 Seidennaht und wenden Sie einen Tupfer von Antibiotikum (50 l) auf den Hals, um bakterielle Infektion zu hemmen.
    HINWEIS: Entfernen Sie beim Wiederöffnen des linken CCA eine Klemme, um eine Beschädigung der Arterienwand zu vermeiden.
  10. Injizieren Sie 0,75 mg/kg Atipamezolhydrochlorid intraperitoneal in die Maus, um der Maus zu helfen, sich schnell von der tiefen Anästhesie erholt zu haben. Bringen Sie die Maus in einen Mauskäfig mit vorgeheizten Pads zurück.
    HINWEIS: Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis die Maus wieder genügend Bewusstsein, um die Brustbeschisse zu erhalten.
  11. Injizieren Sie 0,4 mg/kg Butorphanoltartrat in die Maus, um Schmerzen zu lindern, wenn die Maus aufwacht.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Als erster Hinweis für erfolgreiches tBCCAO ist ein Augenlid-Tropfen der Maus zu beobachten (Abbildung 2).
  12. Zur Euthanasie spritzen Sie den Mäusen 3x MMB-Mischung und opfern sie für Experimente.

3. Allgemeine Beobachtungen (Überlebensraten und Augenlidtropfen)

  1. Überprüfen Sie nach der Operation die Überlebensraten auf alle Todesursachen am Tag 0 (nach der Operation), 1, 3 und 7.
  2. Beurteilen Sie das Augenlid-Tropfen mit einer 4-Punkt-Bewertungsskala: 1 = kein Absinken, 2 = leichtes Absinken (50 %), 3 = schweres Abtropfen (über 50 %) und 4 = starkes Abtropfen mit Augenentladung.

4. Retinale Blutperfusion

  1. Injizieren Sie 200 l FITC-Dextran (25 mg/ml) in den linken Herzkammerschlitz der Maus, die häufig für die Beobachtung der Blutperfusion in mausretinalen Gefäßen13,14verwendet wird.
  2. 2 Minuten nach der Zirkulation die Augen enukleieren und 1 Stunde lang in 4% Paraformaldehyd fixieren. Die Netzhaut wurde, wie zuvor beschrieben15,sorgfältig erhalten und flach montiert und mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht.
  3. Fotografieren Sie die retinalen ganzen Halterungen bei 4-facher Vergrößerung und verschmelzen Sie mit einem Zusammenführungsanalysator zu einem einzigen, zuvor beschriebenen16.
  4. Messen Sie die durchgedreten Bereiche mit einem Gefäßanalysetool in der NIH Fiji/ImageJ-Software.

5. Westlicher Fleck

  1. 3 und 6 Stunden nach tBCCAO, erhalten Sie die Augen von Mäusen und sofort auf eine Petrischale mit kaltem PBS übertragen, um die Netzhaut zu isolieren.
  2. Führen Sie nach der Isolierung der Netzhaut eine westliche Blotting, wie zuvor beschrieben9.
  3. Inkubieren Sie über Nacht mit Antikörpern für den hypoxieinduzierbaren Faktor-1 (HIF-1- und ein allgemeiner Hypoxie-Marker) und für β-Actin (eine interne Belastungskontrolle), gefolgt von der Inkubation von HRP-konjugierten Sekundärantikörpern. Visualisieren Sie die Signale über Chemilumineszenz.

6. Quantitative PCR (qPCR)

  1. 6, 12 und 24 Stunden nach tBCCAO, verarbeiten Sie die erhaltenen Netzhaut für qPCR, wie zuvor beschrieben17.
  2. Führen Sie qPCR über ein Echtzeit-PCR-System aus. Verwendete Primer sind in Tabelle 1aufgeführt. Berechnen Sie Faltenänderungen zwischen Ebenen verschiedener Transkripte nach der Methode "CT".

7. Immunhistochemie (IHC)

  1. 3 Tage nach tBCCAO die Augen von Mäusen erhalten und in Paraffin einbetten.
  2. Schneiden Sie die paraffin-eingebetteten Augen durch ein Mikrotome, um die Augenpartien zu erhalten.
  3. Deparaffinisieren und färben Sie die Augenabschnitte von 5 m Dicke, wie zuvor beschrieben13.
  4. Inkubieren Sie mit einem Antikörper für glialfibrilläres saures Protein (GFAP; ein zuverlässiger Marker für Astrozyten und Müller-Zellen in der Netzhaut) über Nacht, gefolgt von der Inkubation von Alexa Fluor 555-konjugierten Sekundärantikörpern.
  5. Verwenden Sie DAPI (4,6-Diamidino-2-Phenylindole) zur Färbung des Kerns in der Netzhaut. Visualisierung von Signalen über ein Fluoreszenzmikroskop.
  6. Bewerten Sie die Morphologiebewertung anhand einer 4-Punkte-Bewertungsskala, wie zuvor beschrieben13,18: 0 = kein Signal, 1 = wenige positive Glia-Endfüße in der Ganglienzellschicht (GCL), 2 = wenige markierte Prozesse, die von GCL bis zur äußeren Kernschicht (ONL) reichen, und 3 = am meisten markierte Prozesse, die von GCL bis ONL reichen.

8. Elektroretinographie (ERG)

  1. 3 und 7 Tage nach tBCCAO, führen Sie ERG mit einer Ganzfeld-Kuppel, einem Erfassungssystem und LED-Stimulatoren durch, wie zuvor beschrieben9.
  2. Nach dunkler Anpassung über Nacht, beanmaßen Sie Mäuse mit einer Kombination von MMB unter dunklem roten Licht.
  3. Verwenden Sie eine gemischte Lösung von 0,5% Tropicamid und 0,5% Phenylephrin, um die Pupillen zu verdorn.
  4. Legen Sie die aktiven Elektroden auf die Kontaktlinse und legen Sie die Referenzelektrode in den Mund.
  5. Erhalten Sie ERG-Antworten von beiden Augen jedes Tieres.
  6. Zeichnen Sie skotopische Reaktionen unter dunkler Anpassung mit verschiedenen Reizen auf.
  7. Messen Sie die Amplituden der A-Welle von der Grundlinie bis zum tiefsten Punkt der A-Welle.
  8. Messen Sie die Amplituden der B-Welle vom tiefsten Punkt der A-Welle bis zum Gipfel der B-Welle.
  9. Halten Sie alle Mäuse während des Eingriffs mit Wärmepads warm.

9. Optische Kohärenztomographie (OCT)

  1. 2 Wochen nach tBCCAO, führen Sie OCT mit SD-OCT-System, wie zuvor berichtet8,9.
  2. Für die Messung Mäuse einer Mydriasis durch eine gemischte Lösung von 0,5% Tropicamid und 0,5% Phenylephrin und der Vollnarkose durch eine Mischung aus MMB unterziehen.
  3. Erhalten Sie B-Scan-Bilder aus äquatorialen Slices von En-Face-Scans.
  4. Untersuchen Sie die Netzhaut bei 0,2, 0,4 und 0,6 mm vom Sehnervenkopf entfernt.
  5. Messen Sie die Netzhautdicke von der retinalen Nervenfaserschicht (NFL) bis zur externen Grenzmembran (ELM), und betrachten Sie den Durchschnitt der Gemessenen Werte als Netzhautdicke einer einzelnen Maus.
  6. Zeichnen Sie die Ergebnisse als Spinnendiagramme.

Ergebnisse

Nach systemischer Zirkulation von FITC-Dextran für 2 Minuten wurden netzhautvaskulaturen der linken und rechten Netzhaut bei den scheinbetriebenen Mäusen und tBCCAO-betriebenen Mäusen untersucht (Zusatzabbildung 1). FITC-Dextran war sowohl in den Netzhaut bei den scheinbetriebenen Mäusen als auch in der linken Netzhaut bei den tBCCAO-betriebenen Mäusen vollständig sichtbar, während es in der rechten Netzhaut bei den tBCCAO-betriebenen Mäusen teilweise nachweisbar war.

...

Diskussion

In der Studie haben wir gezeigt, dass tBCCAO, mit einfachen Nähten und einer Klemme, netzhautische Ischämie und begleitende Netzhautfunktionsstörung induzieren könnte. Darüber hinaus haben wir unser aktuelles Protokoll für die Entwicklung eines Mausmodells der retinalen Ischämie demonstriert ist einfacher und schneller im Vergleich zu anderen früheren Protokollen für die Entwicklung von retinalen ischämischen Verletzungsmodellen2,3,

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (18K09424 an Toshihide Kurihara und 20K18393 an Yukihiro Miwa) vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Atipamezole hydrochlorideZenoaqAntisedanFor anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 FastApplied Biosystems-For qPCR
Butorphanol tartrateMeiji Seika PharmaVetorphaleFor anesthesia
BZ-II AnalyzerKEYENCE-For an image merge
BALB/cAJc1CLEA-Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAbCST3700For western blot
Clamp ForcepWorld Precision InstrumentsWPI 500451For surgery
Dumont forceps #5Fine Science Tools11251-10For surgery
DAPI solutionDojindo340-07971For IHC
Envisu SD-OCT systemLeicaR4310For OCT
FITC-dextranMerkFD2000SFor retinal blood perfusion
Fluorescence microscopeKEYENCEBZ-9000For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrateSenju PharmaceuticalGachifuroFor anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10)Thermo13-0300For IHC
Heating padMarukanRH-200For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAbCST36169For western blot
ImageQuant LAS 4000 miniGE Healthcare-For chemiluminescence
MidazolamSandoz K.KSANDOZFor anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6Sakura-For sectioning
MedetomidineOrion CorporationDomitorFor anesthesia
Needle holderHandayaHS-2307For surgery
PuRECMAYO Corporation-For ERG
ScissorFine Science Tools91460-11For surgery
Sodium hyaluronateSanten PharmaceuticalHyaleinFor eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochlorideSanten PharmaceuticalMydrin-PFor mydriasis
6-0 silk sutureNatsumeE12-60N2For surgery

Referenzen

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