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Resumen

Aquí, describimos un modelo de ratón de isquemia retiniana por oclusión bilateral transitoria de la arteria carótida común bilateral utilizando suturas simples y una abrazadera. Este modelo puede ser útil para entender los mecanismos patológicos de la isquemia retiniana causados por anomalías cardiovasculares.

Resumen

Diversas enfermedades vasculares como la retinopatía diabética, la oclusión de venas o arterias retinianas y el síndrome isquémico ocular pueden conducir a isquemia retiniana. Para investigar los mecanismos patológicos de la isquemia retiniana, es necesario desarrollar modelos experimentales relevantes. Anatómicamente, un vaso principal de suministro de sangre de retina es la arteria oftálmica (OpA) y OpA se origina en la arteria carótida interna de la arteria carótida común (CCA). Por lo tanto, la interrupción de la CCA podría causar efectivamente isquemia retiniana. Aquí, establecimos un modelo de ratón de isquemia retiniana mediante oclusión bilateral transfronteriza de la arteria carótida común (tBCCAO) para atar la CCA derecha con suturas de seda 6-0 y ocluir la CCA izquierda transitoriamente durante 2 segundos a través de una abrazadera, y demostramos que tBCCAO podría inducir isquemia retiniana aguda que conduce a disfunción retiniana. El método actual reduce la dependencia de los instrumentos quirúrgicos utilizando únicamente agujas quirúrgicas y una abrazadera, acorta el tiempo de oclusión para minimizar la muerte inesperada de animales, que a menudo se ve en modelos de ratón de oclusión arterial cerebral media, y mantiene la reproducibilidad de los hallazgos isquémicos retinianos comunes. El modelo se puede utilizar para investigar la fisiopatología de las retinopatías isquémicas en ratones y más se puede utilizar para la detección de fármacos in vivo.

Introducción

La retina es un tejido neurosensorial para la función visual. Dado que se necesita una cantidad sustancial de oxígeno para la función visual, la retina se conoce como uno de los tejidos más exigentes de oxígeno en el cuerpo1. La retina es susceptible a enfermedades vasculares, ya que el oxígeno se administra a través de los vasos sanguíneos. Varios tipos de enfermedades vasculares, como la retinopatía diabética y la oclusión de los vasos sanguíneos retinianos (venas o arterias), pueden inducir isquemia retiniana. Para investigar los mecanismos patológicos de la isquemia retiniana, se consideran necesarios modelos experimentales reproducibles y clínicamente relevantes de isquemia retiniana. La oclusión arterial cerebral media (MCAO) mediante la inserción de un filamento intraluminal es el método más utilizado para el desarrollo de modelos de roedores in vivo de isquemia cerebral experimental2,3. Debido a la proximidad de la arteria oftálmica (OpA) a MCA, los modelos MCAO también se utilizan simultáneamente para entender la fisiopatología de la isquemia retiniana4,5,6. Para inducir la isquemia cerebral junto con la isquemia retiniana, los filamentos largos se insertan típicamente a través de la incisión de la arteria carótida común (CCA) o la arteria carótida externa (ECA). Estos métodos son difíciles de realizar, requieren mucho tiempo para completar la cirugía (más de 60 minutos para un ratón), y conducen a altas variabilidades en los resultados después de la cirugía7. Sigue siendo importante desarrollar un mejor modelo para mejorar estas preocupaciones.

En este estudio, simplemente utilizamos una breve oclusión bilateral transitoria de CCA (tBCCAO) con agujas y una abrazadera para inducir isquemia retiniana en ratones y analizamos los resultados típicos de lesiones isquémicas en la retina. En este vídeo, daremos una demostración del procedimiento tBCCAO.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Escuela de Medicina de la Universidad keio.

1. Preparación de instrumentos quirúrgicos y animales

  1. Autoclave instrumentos quirúrgicos y mantenerlos en 70% alcohol etílico. Antes de cada nuevo procedimiento quirúrgico, limpie los instrumentos quirúrgicos cuidadosamente usando un 70% de alcohol etílico.
  2. Preparar ratones MACHO BALB/cAJc1 (6 semanas de edad, 26-28 kg) en un espacio específico libre de patógenos (SPF) para mantener condiciones estériles antes, durante y después de la cirugía.

2. Oclusión bilateral transitoria de la arteria carótida común (tBCCAO)

  1. Coloque un ratón bajo anestesia mediante inyección intraperitoneal con una combinación de midazolam (40 μg/100 μL), medetomidina (7,5 μg/100 μL) y tartrato de butorphanol (50 μg/100 μL), denominado "MMB", como se describió anteriormente8,9. Sostenga las pieles traseras del ratón para evitar que el ratón golpee sus ojos hasta que el ratón esté completamente anestesiado.
    1. Juzgue la profundidad de la anestesia pellizcando el dedo del pie del ratón hasta que no tenga respuesta, cuyo método se utiliza comúnmente para comprobar la anestesia completa10.
      NOTA: Generalmente, se requieren menos de 5 minutos para que los ratones se queerman dormidos. Las instituciones pueden ser diferentes para las recetas adecuadas para la anestesia general.
  2. Aplicar una gota de 0.1% solución purificada de gota para los ojos de hialuronato sódico a los ojos para evitar la sequedad en los ojos bajo anestesia.
  3. Coloque el ratón en su parte posterior y fije las patas del ratón usando cintas adhesivas.
  4. Desinfectar el área del cuello del ratón usando un 70% de alcohol etílico antes de la cirugía.
    NOTA: No se realizó un recorte adicional de la piel, ya que esto puede causar inflamación posterior de la piel11,12.
  5. Realizar incisión sagital del cuello con una cuchilla (Figura 1).
    NOTA: La incisión debe hacerse en la línea media entre el cuello, el esternón y la tráquea.
  6. Separe cuidadosamente ambas glándulas salivales usando cuidadosamente dos fórceps y moviélgas para visualizar los CCA subyacentes.
  7. Aísle cuidadosamente a la CCA derecha de los respectivos nervios vagal y venas que lo acompañan sin dañar sus estructuras, y coloque dos suturas de seda 6-0 bajo el CCA. Ata los dos lazos firmemente para bloquear el flujo sanguíneo(Figura 1).
    NOTA: Durante el procedimiento, las venas pequeñas podrían dañarse. Si se observa sangrado, se requiere la limpieza para visualizar claramente los CCA.
  8. Encuentra el CCA izquierdo cuidadosamente de los respectivos nervios vagal y venas que lo acompañan sin dañar sus estructuras, y ocluye el CCA izquierdo durante 2 segundos por una abrazadera(Figura 1).
    NOTA: Se necesita una aguja de sutura de seda de 6-0 para ser colocada debajo de la CCA izquierda para marcar un sitio para la sujeción.
  9. Después de la reapertura de la CCA izquierda, sutura heridas del cuello por una sutura de seda 6-0 y aplicar un toque de antibióticos (50 μL) en el cuello para inhibir la infección bacteriana.
    NOTA: Retire suavemente una abrazadera para evitar dañar la pared arterial al reabrir el CCA izquierdo.
  10. Inyecte 0,75 mg/kg de clorhidrato de atipamezol por vía intraperitoneally al ratón para ayudar al ratón a recuperarse rápidamente de la anestesia profunda. Devuelve el ratón a una jaula de ratón con almohadillas precalentados.
    NOTA: No deje que el ratón quede desatendido hasta que el ratón recupere la conciencia suficiente para mantener la recumbencia severa.
  11. Inyectar 0,4 mg/kg de tartrato de butorphanol en el ratón para el manejo del dolor cuando el ratón se despierta.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Como primera pista para el éxito de tBCCAO, se puede observar la caída del párpado del ratón (Figura 2).
  12. Para la eutanasia, inyecte 3x de mezcla de MMB a los ratones y sacrifique para experimentos.

3. Observaciones generales (tasas de supervivencia y caída de párpados)

  1. Después de la cirugía, compruebe las tasas de supervivencia de todas las causas de muerte en el día 0 (después de la cirugía), 1, 3 y 7.
  2. Evaluar el caída del párpado por una escala de clasificación de 4 puntos: 1 = sin caídas, 2 = caída leve (~50%), 3 = caída grave (más del 50%), y 4 = caída severa con secreción ocular.

4. Perfusión de sangre retiniana

  1. Inyectar 200 μL de FITC-dextran (25 mg/ml) en el ventrículo izquierdo del ratón, que se utiliza comúnmente para la observación de perfusión de sangre en vasos retinianos de ratón13,14.
  2. 2 minutos después de la circulación, enuclear los ojos y fijar en 4% paraformaldehído durante 1 hora. Las retinas fueron cuidadosamente obtenidas y montadas planas, como se describió anteriormente15,y examinadas a través de un microscopio de fluorescencia.
  3. Tome fotografías de los soportes enteros de la retina a una ampliación de 4x y combínese en una sola usando un analizador de fusión, descrito previamente16.
  4. Mida las áreas perfundidas a través de una herramienta de análisis de buques en el software NIH Fiji/ImageJ.

5. Mancha occidental

  1. 3 y 6 horas después de tBCCAO, obtener los ojos de ratones y transferir inmediatamente a una placa De Petri que contiene PBS frío para aislar las retinas.
  2. Después del aislamiento de las retinas, realice la hinchazón occidental, como se describió anteriormente9.
  3. Incubar con anticuerpos para el factor-1α inducible a la hipoxia (HIF-1α; un marcador de hipoxia general) y para β-Actin (un control interno de carga) durante la noche seguido de la incubación de anticuerpos secundarios conjugados por HRP. Visualice las señales a través de la quimioluminiscencia.

6. PCR cuantitativo (qPCR)

  1. 6, 12 y 24 horas después de tBCCAO, procesar las retinas obtenidas para qPCR, como se describió anteriormente17.
  2. Realice qPCR a través del sistema PCR en tiempo real. Las imprimaciones utilizadas se enumeran en la Tabla 1. Calcule los cambios de pliegue entre los niveles de diferentes transcripciones mediante el método ΔΔCT.

7. Inmunohistoquímica (IHC)

  1. 3 días después de tBCCAO, obtener los ojos de ratones e incrustar en parafina.
  2. Corta los ojos incrustados en parafina por un microtome para obtener las secciones oculares.
  3. Desfinalice y manche las secciones oculares de 5 μm de espesor como se describió anteriormente13.
  4. Incubar con un anticuerpo para proteína ácida fibrilariana glial (GFAP; un marcador fiable para astrocitos y células de Müller en la retina) durante la noche seguido de la incubación de anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 555.
  5. Utilice DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) para manchar el núcleo en la retina. Visualice las señales a través de un microscopio de fluorescencia.
  6. Evalúe la puntuación de morfología por una escala de clasificación de 4 puntos, como se describió anteriormente13,18: 0 = sin señal, 1 = pocos pies finales gliales positivos en la capa de células gangliona (GCL), 2 = pocos procesos etiquetados que llegan de GCL a la capa nuclear externa (ONL), y 3 = la mayoría de los procesos etiquetados que llegan de GCL a ONL.

8. Electroretinografía (ERG)

  1. 3 y 7 días después de tBCCAO, realizar ERG utilizando un domo Ganzfeld, sistema de adquisición y estimuladores LED, como se describió anteriormente9.
  2. Después de la adaptación oscura durante la noche, anestesia a ratones con una combinación de MMB bajo luz roja tenue.
  3. Utilice una solución mixta de 0,5% tropicamida y 0,5% fenilefrina para dilatar las pupilas.
  4. Coloque los electrodos activos en la lente de contacto y coloque el electrodo de referencia en la boca.
  5. Obtenga respuestas ERG de ambos ojos de cada animal.
  6. Registre las respuestas escocesas bajo una adaptación oscura con varios estímulos.
  7. Mida las amplitudes de una onda desde la línea base hasta el punto más bajo de una onda.
  8. Mida las amplitudes de onda b desde el punto más bajo de una onda hasta el pico de onda b.
  9. Mantenga a todos los ratones calientes durante el procedimiento usando almohadillas de calor.

9. Tomografía de coherencia óptica (OCT)

  1. 2 semanas después de tBCCAO, realice OCT utilizando el sistema SD-OCT, como se informó anteriormente8,9.
  2. Para la medición, someta a los ratones a la mydriasis mediante una solución mixta de 0,5% de tropicamida y 0,5% fenilefrina, y a anestesia general por una mezcla de MMB.
  3. Obtenga imágenes de escaneo B de sectores ecuatoriales de escaneos en la cara.
  4. Examine las retinas a 0,2, 0,4 y 0,6 mm de la cabeza del nervio óptico.
  5. Mida el grosor de la retina desde la capa de fibra nerviosa retiniana (NFL) hasta la membrana limitante externa (OLMO), y considere el promedio de los valores medidos como grosor retiniano de un ratón individual.
  6. Trace los resultados como diagramas de arañas.

Resultados

Después de la circulación sistémica de FITC-dextran durante 2 minutos, se examinaron las vasculaturas retinianas de las retinas izquierda y derecha en ratones operados por sham y ratones operados por tBCCAO(Figura Suplementaria 1). Fitc-dextran era totalmente visible en las dos retinas en los ratones operados por sham y la retina izquierda en los ratones operados por tBCCAO, mientras que era parcialmente detectable en la retina derecha en los ratones operados por tBCCAO.

De...

Discusión

En el estudio, hemos demostrado que la tBCCAO, utilizando suturas simples y una abrazadera, podría inducir isquemia retiniana y disfunción retiniana que lo acompaña. Además, hemos demostrado que nuestro protocolo actual para el desarrollo de un modelo de ratón de isquemia retiniana es más fácil y rápido en comparación con otros protocolos anteriores para el desarrollo de modelos de lesiones isquémicas retinianas2,3,7.<...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por grants-in-aid for Scientific Research (KAKENHI) (18K09424 a Toshihide Kurihara y 20K18393 a Yukihiro Miwa) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Atipamezole hydrochlorideZenoaqAntisedanFor anti-anesthesia
Applied Biosystems 7500 FastApplied Biosystems-For qPCR
Butorphanol tartrateMeiji Seika PharmaVetorphaleFor anesthesia
BZ-II AnalyzerKEYENCE-For an image merge
BALB/cAJc1CLEA-Mouse strain
β-Actin (8H10D10) Mouse mAbCST3700For western blot
Clamp ForcepWorld Precision InstrumentsWPI 500451For surgery
Dumont forceps #5Fine Science Tools11251-10For surgery
DAPI solutionDojindo340-07971For IHC
Envisu SD-OCT systemLeicaR4310For OCT
FITC-dextranMerkFD2000SFor retinal blood perfusion
Fluorescence microscopeKEYENCEBZ-9000For fluorescence detection
Gatifloxacin hydrateSenju PharmaceuticalGachifuroFor anti-bacterial infection
GFAP Monoclonal Antibody (2.2B10)Thermo13-0300For IHC
Heating padMarukanRH-200For surgery
HIF-1α (D1S7W) XP Rabbit mAbCST36169For western blot
ImageQuant LAS 4000 miniGE Healthcare-For chemiluminescence
MidazolamSandoz K.KSANDOZFor anesthesia
Microtome Tissue-Tek TEC 6Sakura-For sectioning
MedetomidineOrion CorporationDomitorFor anesthesia
Needle holderHandayaHS-2307For surgery
PuRECMAYO Corporation-For ERG
ScissorFine Science Tools91460-11For surgery
Sodium hyaluronateSanten PharmaceuticalHyaleinFor eye lubrication
Tropicamide/Penylephrine hydrochlorideSanten PharmaceuticalMydrin-PFor mydriasis
6-0 silk sutureNatsumeE12-60N2For surgery

Referencias

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