从预成型微气泡生产膜过滤相移十氟丁烷纳米滴

摘要

该协议描述了一种使用探针尖端超声处理产生大量脂质封装的十氟丁烷微气泡的方法，然后使用高压挤出和机械过滤将它们冷凝成相移纳米滴。

摘要

有许多方法可用于生产用于成像和治疗的可蒸发相移液滴。每种方法都使用不同的技术，并且在价格，材料和目的方面有所不同。许多这些制造方法导致具有不均匀激活阈值的多分散群体。此外，控制液滴大小通常需要稳定的全氟碳液体，其高活化阈值在体内是不切实际的。使用低沸点气体产生均匀的液滴尺寸将有利于体内成像和治疗实验。本文介绍了一种简单而经济的方法，用于形成具有低沸点十氟丁烷（DFB）的尺寸过滤脂质稳定的相移纳米滴。描述了产生脂质微气泡的常用方法，以及一种在单个步骤中用高压挤出冷凝它们的新方法。该方法旨在节省时间，最大限度地提高效率，并使用许多生物实验室中的常见实验室设备为各种应用生成更大体积的微气泡和纳米滴解决方案。

引言

超声造影剂（UCA）在成像和治疗应用中迅速普及。微气泡是最初的UCAs，目前是临床诊断应用中使用的主流药物。微气泡是充满气体的球体，通常直径为1-10μm，周围是脂质、蛋白质或聚合物壳¹。然而，它们的大小和体内稳定性会限制它们在许多应用中的功能。相移纳米滴含有过热的液芯，由于其尺寸更小，循环寿命更高，因此可以克服其中一些限制²。当暴露于热或声能时，过热的液芯蒸发形成气体微气泡^{2，3，4，5}。由于汽化阈值与液滴大小^5，6直接相关，因此配制大小均匀的液滴悬浮液对于实现一致的活化阈值是非常理想的。产生均匀液滴尺寸的配方方法通常复杂且成本高昂，而更具成本效益的方法则会产生多分散解决方案⁷。另一个限制是能够产生具有低沸点全氟化碳（PFC）气体的稳定相移液滴，这对于体内高效活化至关重要⁸。在这份手稿中，描述了一种方案，用于产生稳定的过滤的低沸点可汽化相移液滴，用于体内成像和治疗应用。<....

研究方案

1. 制作脂质薄膜

1. 使用90%DSPC和10%DSPE-PEG2K制备用于微气泡生成的脂质薄膜，方法是使用以下方向以正确的比例混合脂质：
   1. 在氯仿中制造DSPC和DSPE-PEG2K的储备脂质。在单独的小瓶中称量50mg每种脂质粉末。使用1 mL玻璃注射器向每个小瓶中加入1 mL氯仿。
   2. 使用玻璃注射器将287μLDSPC储备液和113μLDSPE-PEG2K储备液（均为50mg / mL）加入20mL闪烁小瓶中。
   3. 用氮气干燥混合脂质以除去氯仿。使用与室内氮气连接的适当长度的管道，在混合时在小瓶的顶部空间上轻轻流动氮气。继续直到没有观察到氯仿，剩余的脂质膜开始变白。使用聚丙烯螺旋盖，盖上样品，同时在顶空引入氮气。
   4. 使用真空干燥器将小瓶置于真空下过夜，以除去任何残留的氯仿。将保留一层薄薄的半透明薄膜，覆盖小瓶的底部。
   5. 将小瓶储存在-20°C直至需要。

2. 从脂质薄膜产生微气泡

1. 为了产生微气泡，将10 mL含有20%v / v丙二醇和20%v v甘油（最终pH 7.2-7.4）的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）加入干燥的脂质膜中。
2. 将样品重新盖上盖子，并将样品加热到65°C，在加热块（或热水浴）上30分钟。
3. 当样品变暖时，通过将浴温升高至65°C来准备浴超声仪。

结果

使用动态光散射（DLS）和可调阻脉冲检测（TRSP）分析，包括尺寸分布的代表性结果。图5显示了有和不带挤出的冷凝气泡溶液的尺寸分布。在没有挤出的情况下，实验方案在步骤5.3结束。冷却的气泡通过在冷时将样品排放到大气压来冷凝。仅浓缩的样品具有更宽的分布，集中在400nm附近。挤出的样品具有较窄的分布，集中在200nm处。两个样本都包括脂质体和液滴，使用DLS无法?.......

讨论

有一套全面的文献，讨论了微气泡和相移液滴在体内成像和治疗中的配方、物理原理和潜在应用。该讨论明确涉及产生脂质微气泡，并使用低沸点DFB气体和高压挤出将其转化为亚微米相移液滴。这里概述的方法旨在通过将先前的微气泡缩合方法与液滴挤出相结合，提供一种相对简单的生产大量脂质微气泡和DFB相移液滴的方法。这种方法具有产生高浓度气泡的优点，用于形成基于过滤器选择的具有?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Centrifuge Tubes	Falcon	352095	Collecting and centrifuging droplets
200 nm polycarbonate filter	Whatman	110606	Extruder filters
2-methylbutane	Fisher Chemical	03551-4	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
3-prong clamps X2	Fisher	02-217-002	Holding scintilation vials in place for probe tip sonication
400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn	Branson	101-063-198R	Used to generate lipid microbubbles from lipid solution
Bath Sonicator	Fisher Scientific	15337402	Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles
Chloroform	Fisher Bioreagents	C298-4	Used to make lipid film for microbubble preperation
Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas	FluoroMed L.P.	1 kg	generating microbubbles via probe tip sonication
Dry Ice	-	-	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
DSPC Lipid Powder	NOF America	COATSOME MC-8080	Component of lipid film
DSPE-PEG-2K Lipid Powder	NOF America	SUNBRIGHT DSPE-020CN	Component of lipid film
General Thermometer	-	-	Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures)
Glass Syringes	Hamilton	81139	Used to mix lipids in chloroform
Glycerol	Fisher Bioreagents	BP229-1	Reduces freezing temperature of PBS solution
Heating Block	VWR Scientific Products		Heating lipid films and vaporizing droplets
Lipex 10 mL Extruder	Evonik		Commercial high-pressure extrusion system
Mini Vortex Mixer	Fisher brand	14-955-151	Used to remove excess chloroform from lipid films
Nitrogen Tank	-	-	Used to operate extruder
Phosphate Buffer Saline	Fisher Scientific		Hydrate lipid films and washing droplets
Polyester Drain Disk	Whatman	230600	Provides support for polycarbonate filter
Polypropylene Caps	Fisher Scientific	298417	Used for solution storage
Propylene Glycol	Fisher Chemical	P355-1	Reduces freezing temperature of PBS solution
Scintiliation Vials	DWK Life Sciences Wheaton	986532	Used for lipid films and microbubble generation
Small hammer	-	-	Used to break apart dry ice for cooling methylbutane
Sonicator Microtip Attachment	Branson	101148070	Used to generate microbubbles from lipid solution
Steel Container	Medegen	79310	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work)
Vacuume Dessicator	Bel-Art SP Scienceware	08-648-100	Removes excess chloroform from lipid films
2mL Centrifuge Tube	Fisher	02682004	Used for concentrating nanodroplets