プレフォームマイクロバブルからの膜濾過相シフトデカフルオロブタンナノ液滴の製造

要約

このプロトコルは、プローブチップ超音波処理を使用して大量の脂質カプセル化デカフルオロブタンマイクロバブルを生成し、その後、高圧押出および機械的濾過を使用してフェーズシフトナノ液滴に凝縮する方法を記述する。

要約

画像処理および治療のための気化可能な位相シフト液滴の製造に使用できる多くの方法があります。各方法は、さまざまな技術を利用し、価格、材料、目的が異なります。これらの製造方法の多くは、不均一な活性化閾値を有する多分散集団をもたらす。さらに、液滴サイズを制御するには、通常、生体内で実用的ではない高い活性化閾値を有する安定したパーフルオロカーボン液体が必要です。低沸点ガスを用いて均一な液滴サイズを作製することは、インビボイメージングおよび治療実験に有益であろう。本稿では、低沸点デカフルオロブタン(DFB)を用いたサイズフィルター脂質安定化位相シフトナノ液滴の形成のための、簡便で経済的な方法について述べている。脂質マイクロバブルを生成する一般的な方法は、一回のステップで高圧押出でそれらを凝縮する新しい方法に加えて、記載されている。この方法は、多くの生物学的実験室で見られる一般的な実験装置を使用して、時間を節約し、効率を最大化し、マイクロバブルおよびナノドロップレットソリューションの大量を生成するように設計されています。

概要

超音波造影剤(UCA)は、画像および治療用途で急速に人気が高まっています。マイクロバブルは、元のUCAであり、現在臨床診断アプリケーションで使用される主流の薬剤です。マイクロバブルは、ガスで満たされた球体で、通常は直径1~10μmで、脂質、タンパク質、ポリマーシェル¹で囲まれています。ただし、そのサイズと生体内での安定性は、多くのアプリケーションで機能を制限することができます。過熱した液体コアを含む位相シフトナノドロップレットは、サイズが小さく、^{循環寿命が}改善されたため、これらの制限のいくつかを克服することができます。熱または音響エネルギーにさらされると、過熱した液体コアが気化して気体マイクロバブル^{2,3,4,5を形成します}。気化閾値は液滴サイズ^5,6に直接関係するため、一貫した活性化閾値を達成するために、一様なサイズの液滴懸濁液を処方することが非常に望ましいであろう。均一な液滴サイズを生成する配合方法は、しばしば複雑でコストがかかり、より費用対効果の高いアプローチは多分散溶液⁷をもたらす。もう一つの制限は、低沸点パーフルオロカーボン(PFC)ガスで安定な位相シフト液滴を生成する能力であり、これは^vivo8での効率的な活性化に不可欠です。本稿では、生体内イメージングおよび治療用途のための安定したろ過低沸点気化可能な位相シフト液滴を生成するためのプロトコルが記載されている。

単分散サブミクロン位相^{シフト液滴}7を製造する方法は多い。サイズを制御する最も堅牢な方法の1つは、マイクロ流体デバイスの使用です。これらのデバイスは、コストがかかり、液滴の生産速度が遅く(〜104-106液滴/s)⁷であり、広範なトレーニングが必要です。マイクロ流体デバイスは、一般に、システム⁷の自発的な気化や目詰まりを避けるために、高沸点ガスを必要とします。しかし、de Gracia Luxら.⁹の最近の研究では、マイクロフルダイザーを冷却して、低沸点デカフルオロブタン(DFB)またはオクターフルオロプロパン(OFP)を使用して高濃度のサブミクロン位相シフト(^1010-1012/mL)を生成する方法を示しています。

一般に、DFBやOFPなどの低沸点ガスは、あらかじめ形成された気泡を使用して扱いやすくなっています。気化可能な液滴は、低温および上昇圧^5,10を用いてガスを凝縮することにより、前駆体脂質安定化気泡から生成することができる。この方法を用いて生成される液滴の濃度は、前駆体マイクロバブル濃度と気泡から液滴への変換の効率に依存する。濃縮されたマイクロバブルは、¹⁰¹⁰ MB/^mL11>近づく先端超音波処理から報告されているが、別の研究では、凝縮されたOFPおよびDFP気泡¹²から〜1〜3 ^x1011液滴/mLに及ぶ液滴濃度が報告されている。単分散液滴が懸念されない場合、凝縮方法は、低沸点PFCを使用して脂質安定化位相シフト液滴を生成する最も簡単で最も低コストの方法です。しかし、単分散前駆体気泡の発生も困難であり、マイクロ流体や繰り返し微分遠心分離技術などのより高価なアプローチを必要とする¹¹。DFBおよびOFBナノ液滴を産生するための別のアプローチは、最近、リポソーム¹³における液滴の自発的核形成を用いて発表された。この方法は、「Ouzo」効果を利用して、気泡を凝縮することなく低沸点PFC液滴を生成する簡単な方法である。PFC液滴のサイズ分布は、液滴の核形成を開始するために使用されるPFC、脂質、およびエタノール成分を繊細な滴定および混合することによって制御することができる。また、パーフルオロカーボンの混合は、ナノ液滴^14,15の安定性および活性化閾値を制御するために使用できることも注目に値する。Shakyaらの最近の研究は、炭化水素内の高沸点PFCsを炭化水素内の高沸点PfFCを乳化して、液滴コア¹⁶内の異種核形成を容易にすることによってナノドロップレット活性化を調整する方法を示している。

いったん形成されると、位相シフト液滴を形成後に押し出して、より多くの単分散集団を作り出すことができる。実際、ここで説明する方法と同様のプロトコルは、高沸点ドデデオフルオルペンタン(DDFP)を液滴コアとして使用してKopechekら¹⁷ によって以前に公開されている。高沸点パーフルオロカーボン(室温で安定)を有する位相シフト液滴を使用しようとする読者は、代わりに上記の記事を参照する必要があります。DFBやOFPなどの低沸点ガスを含む液滴の発生と押出は、より複雑であり、あらかじめ形成された気泡を凝縮させることで最もアプローチが可能です。

このプロトコルでは、プローブ先端超音波処理を用いてDFBガスコアを用いて事前に形成された脂質微小気泡を生成する一般的な方法が記載されている。次に、市販の押出機を使用して、プレフォームされたマイクロバブルをサブミクロン位相シフトナノ液滴に凝縮します(図1)。得られた液滴は、熱と超音波によって活性化可能である。この方法は、高価なマイクロ流体デバイスを必要とせずに、より狭いサイズ分布を有する従来の凝縮法よりも大量のナノ液滴溶液を生成することができる。狭いサイズ分布を持つナノドロップレット溶液の製造は、より均一な気化閾値を生成する可能性が高い。これは、画像処理、アブレーション、薬物送達、塞栓術^{1、3、4、6}などの多数のアプリケーションの可能性を最大限に引き出します。

図1:予知されたマイクロバブルを位相シフトナノ液滴に凝縮するための高圧押出セットアップの概略図。 マイクロバブル溶液は押出機室に添加され、収容され、250psiは、窒素タンクから、チャンバー入口弁を通して適用される。窒素ガスは、マイクロバブル溶液をチャンバの基部のフィルターを通して押し出し、サンプルをナノ液滴に凝縮させる。溶液は最終的にサンプル出口管を通して押出機から押し出され、収集される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

1. 脂質フィルムの作成

1. 以下の方向を使用して正しい比率で脂質を混合することにより、90%DSPCおよび10%DSPE-PEG2Kを使用してマイクロバブル生成用の脂質膜を調製する:
   1. クロロホルムでDSPCとDSPE-PEG2Kのストック脂質を作ります.各脂質粉末の50mgを別々のバイアルで秤量する。1 mL ガラスシリンジを使用して、各バイアルにクロロホルム 1 mL を加えます。
   2. ガラスシリンジを使用して20 mLシンチレーションバイアルにDSPCストック287 μLとDSPE-PEG2Kストック113 μL(両方とも50 mg/mL)を加えます。
   3. 混合脂質を乾燥させて、窒素を用いてクロロホルムを除去する。ハウス窒素に接続されたチューブの適切な長さを使用して、混合しながらバイアルのヘッドスペース上に窒素ガスを軽く流します。クロロホルムが見られないまで続け、残りの脂質膜が白色に変わり始める。ポリプロピレンスクリューキャップを使用し、ヘッドスペースに窒素を導入しながらサンプルをカバーします。
   4. 真空デシケータを使用して一晩真空下にバイアルを置き、残留クロロホルムを除去します。薄い半透明のフィルムは、バイアルの底をコーティングしたままになります。
   5. 必要になるまで-20°Cでバイアルを保管してください。

脂質膜からのマイクロバブルの発生

1. マイクロバブルを作るために、20%v/vプロピレングリコールを含む1xリン酸緩衝塩水(PBS)の10 mLと20%v/vグリセロール(最終pH 7.2-7.4)を乾燥した脂質フィルムに加えます。
2. サンプルと温かいサンプルを65°Cに再キャップし、加熱ブロック(または温水バス)で30分間加熱します。
3. 試料が温まる間、浴温を65°Cに上げることで浴用超音波処理器を準備する。
   注:このプロセスは、水がバス超音波処理器に入れる前に電子レンジまたはホットプレートで予熱されている場合は、より高速です。
4. 温めたサンプルを含むシンチレーションバイアルを浴用超音波処理器に入れ、脂質溶液を含むバイアルの部分のみが水浴中に沈むようにする。
5. 最低15分間、暖かい脂質溶液を超音波処理します。水温が65°Cのままであることを確認してください。 溶液が完全に明確になるまで、10〜15分の間隔で超音波処理を続けます(図2)。
   注:バスソニエーターが利用できない場合、解決策は、クリアするまで10%の電力で超音波処理することができます。しかし、マイクロチップはより速く摩耗し、交換する方が高価です。

図2:水和脂質フィルムの例 水和脂質フィルム(A)前及び(B)浴超音波処理後の例は、ユニラメラ小胞を形成する。浴超音波処理に続いて、脂質溶液はより不透明から半透明の溶液に移行する必要があります。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

6. まだ暖かい間に、キャップを取り外し、超音波装置のマイクロチップアタッチメントが空気/液体インターフェイスのすぐ下に沈むように、バイアルを超音波処理器の防音エンクロージャにクランプします(図3)。
7. 超音波装置の防音エンクロージャの隣にデカフルオロブタンのタンクを置きます。
8. 氷浴を準備し、防音エンクロージャの隣に置きます。これは、ステップ 2.14 の後半で使用されます。
9. 超音波処理器の電源スイッチをオンにします。
10. システムの起動後、電力レベルを 70% に設定します。マイクロチップアタッチメントで70%の振幅を超えないようにしてください。この時点でソニッカレーターを起動しないでください。
11. DFBタンク出口からエンクロージャに保持されている暖かい脂質溶液にガスを導くために、チューブの適切な長さを取り付けます。チューブは、超音波処理中にヘッドスペースにガスが流れ込むように、バイアルの首にちょうど置く必要があります(図3)。
12. ガスが脂質溶液の上を流れるのが見えるまで、タンクバルブをゆっくりと開きます。これは、液体の表面にわずかな波紋を引き起こすでしょう。ガスの流れが高すぎると、マイクロバブル製剤中に溶液が溢れます。
13. 超音波処理器を起動し、マイクロバブルを生成するために連続して10 sのために実行します。バブル溶液が超音波処理中にオーバーフローし始めた場合は、すぐに超音波処理を停止します。
14. 超音波処理器をオフにし、すぐにDFBタンクバルブを閉じます。
15. マイクロバブル溶液を素早くキャップし、氷浴にバイアルを浸し、サンプルを55°C以下に冷却する(DSPCのガラス転移温度)
16. 必要になるまで氷浴にマイクロバブルサンプルを残します。

図3:マイクロバブル形成を最適化するための脂質溶液へのプローブ先端の配置 プローブの先端がガラスに触れないように注意してください。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

3. マイクロバブル凝縮のための押出機の準備

1. 200 nmのセラミックフィルター(メーカーから供給)を使用して、ユーザーズマニュアルに詳述されているように高圧押出機を組み立てます。
2. 押出機を水密容器の中央に置き、サンプル出口管が側面に押し付けたり圧着したりしないようにします。
3. メーカーから供給されたアダプターを使用して、押出機を窒素ガスタンクに結合します。
4. 400mLの水と10gの塩化ナトリウムを使用して、押出機の周りの水密容器に-2°Cの塩漬け氷浴を作ります。
5. 押し出されたサンプルを集めるために、シンチレーションバイアルに出口管の端部を置きます。
   注:チューブが平らに置かれていない場合やバイアル内に留まらない場合は、テープで容器にチューブを固定します。

マイクロバブル凝縮のための押出機のプライミング

1. 押出機内に圧力がないことを確認するために、リリースバルブを開閉します。
2. チャンバー蓋を取り外し、1x PBSの5mLを押出機室に加えます。
3. 蓋を取り替え、しっかりとクリックして元の場所に戻します。
4. 圧力計が250 psiを読み取るように窒素ガスタンクを開きます。圧力制御バルブが閉じた位置に位置していることを確認します。
5. ガスタンクを閉じ、押出機室の入口バルブを開きます。PBS溶液は、システムを介して、シンチレーションバイアルにサンプル出口チューブを押し出されます。
6. ガスだけがチューブから出るとき、解放弁を開き、圧力が0 psiに落ちるようにしなさい。
7. シンチレーションバイアルを取り外します。

5. 押出し用のマイクロバブルを冷却する前

1. 押出機内に圧力がないことを確認するために、リリースバルブを開閉します。出口管の端に新しいシンチレーションバイアルを置く。
2. 鋼容器に2-メチルブタンを充填し、ドライアイスを加え、温度を-18 °Cまで下げる。
3. 冷却された2-メチルブタンにマイクロバブル溶液を挿入し、サンプルを2分間水没させます。2分を通してシンチレーションバイアルを動かして、気泡を軽く混ぜます。必要に応じてドライアイスを加え、-15~-18 °Cの間の温度を維持します。 -20°Cを超えないように注意するか、または賦形液が凍結し、気泡サンプルを破壊します。
   注: ステップ 5.2 および 5.3 は、より長期間にわたって実験室の冷凍庫で泡サンプルを冷却することによっても行うことができます。ただし、冷凍庫の温度を注意深く監視し、サンプルを凍結しないように注意してください。
4. 2分後、冷やした2-メチルブタンからマイクロバブルを取り出し、バイアルを軽く振ってマイクロバブルを混ぜ、冷やした10 mLシリンジを使用して溶液を押出機に移します。
5. 押出機室の蓋を取り外し、シリンジのプランジャーをゆっくりと押してマイクロバブル溶液をチャンバーに加えます。押出機のキャップを交換して、確実に所定の位置に戻ってクリックします。
6. 押出機の圧力制御弁と解放弁が閉じた位置にあるか確認します。
7. 圧力計が250 psiを読み取るまで窒素ガスタンクを開き、ガスタンクを閉じて、圧力制御バルブを開いた位置に回します。
8. 溶液が出口管でシンチレーションバイアルを満たし、ガスだけがチューブを出るとき、圧力解放弁をゆっくりと開き、圧力が0 psiに落ちるようにする。
9. シンチレーションバイアルを氷浴または冷蔵庫に入れて保管します。
10. 長期保存と自然気化を最小限に抑えるために、サンプルを標準の冷凍庫に保管してください。サンプルの凍結を避けるために温度が-20°C以上であることを確認してください(20%PPGと20%グリセロールの賦形液は、ほとんどの実験室の冷凍庫で凍結からサンプルを保ちます)。

6. 遠心分離によるリポソームからの液滴の分離

1. 押し出された液滴溶液の10mLを15mL遠心分離管に移す。
2. 押し出しサンプルを1,500xgで4°Cで10分間遠心する。 DFBナノ液滴から構成されるペレットは、チューブの底部に明らかになります(図4)。自然気化した液滴は溶液の上部に現れ、廃棄されるべきである。

図4:遠心分離後にペレット化された位相シフトDFB液滴の例。 DFBナノ液滴はリポソームよりも密度が高く、ペレット(赤いボックス)の遠心管の底に集まりるでしょう。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

3. 上清を取り除き、20%グリセロールと20%プロピレングリコールで1x PBSの2 mLでペレットを再懸濁します。
4. チューブを軽く混ぜて均質な溶液を得て、液滴を小さい2 mL遠心管に移します。
5. サンプルを2 mL遠心分離管でさらに2回洗浄します。
6. 最後の洗浄後、20%グリセロールと20%プロピレングリコールで1x PBSの100 μLでペレットを再懸濁し、必要になるまで氷の上または冷凍庫に保管します。

7. 液滴気化の顕微鏡検証

1. 濃縮液滴2.5μlを1x PBSの7.5 μlに加えて希釈液溶液を作ります。
2. 希釈サンプル10 μlで顕微鏡スライドを準備します。40xの目的を使用して、サンプルを観察し、画像を保存します。
3. 顕微鏡からスライドを取り出し、65°Cのヒートプレートに1分間置き、ナノ液滴をマイクロバブルに気化させます。
4. 加熱後にサンプルを観察し、液滴気化を確認するために、同じ40x目的を使用してください。

結果

サイズ分布の代表的な結果は、動的光散乱(DLS)および調整可能な抵抗パルスセンシング(TRSP)分析を用いて含まれる。図5は、押出しの有無にかかわらず、凝縮された気泡溶液のサイズ分布を示しています。押し出しがない場合、プロトコルはステップ 5.3 で終了します。冷たい気泡は、冷たい間に大気圧にサンプルを通すことによって凝縮される。凝縮されたサンプルだ?...

ディスカッション

インビボイメージングと治療のためのマイクロバブルと位相シフト液滴の処方、物理学、および潜在的な用途を議論する包括的な文献体が利用可能です。この議論は、脂質マイクロバブルを生成し、低沸点DFBガスと高圧押出を使用してサブミクロン位相シフト液滴に変換することに明示的に関連しています。ここで概説する方法は、従来のマイクロバブル凝縮法と液滴押出法を一回のステッ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Centrifuge Tubes	Falcon	352095	Collecting and centrifuging droplets
200 nm polycarbonate filter	Whatman	110606	Extruder filters
2-methylbutane	Fisher Chemical	03551-4	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
3-prong clamps X2	Fisher	02-217-002	Holding scintilation vials in place for probe tip sonication
400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn	Branson	101-063-198R	Used to generate lipid microbubbles from lipid solution
Bath Sonicator	Fisher Scientific	15337402	Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles
Chloroform	Fisher Bioreagents	C298-4	Used to make lipid film for microbubble preperation
Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas	FluoroMed L.P.	1 kg	generating microbubbles via probe tip sonication
Dry Ice	-	-	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
DSPC Lipid Powder	NOF America	COATSOME MC-8080	Component of lipid film
DSPE-PEG-2K Lipid Powder	NOF America	SUNBRIGHT DSPE-020CN	Component of lipid film
General Thermometer	-	-	Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures)
Glass Syringes	Hamilton	81139	Used to mix lipids in chloroform
Glycerol	Fisher Bioreagents	BP229-1	Reduces freezing temperature of PBS solution
Heating Block	VWR Scientific Products		Heating lipid films and vaporizing droplets
Lipex 10 mL Extruder	Evonik		Commercial high-pressure extrusion system
Mini Vortex Mixer	Fisher brand	14-955-151	Used to remove excess chloroform from lipid films
Nitrogen Tank	-	-	Used to operate extruder
Phosphate Buffer Saline	Fisher Scientific		Hydrate lipid films and washing droplets
Polyester Drain Disk	Whatman	230600	Provides support for polycarbonate filter
Polypropylene Caps	Fisher Scientific	298417	Used for solution storage
Propylene Glycol	Fisher Chemical	P355-1	Reduces freezing temperature of PBS solution
Scintiliation Vials	DWK Life Sciences Wheaton	986532	Used for lipid films and microbubble generation
Small hammer	-	-	Used to break apart dry ice for cooling methylbutane
Sonicator Microtip Attachment	Branson	101148070	Used to generate microbubbles from lipid solution
Steel Container	Medegen	79310	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work)
Vacuume Dessicator	Bel-Art SP Scienceware	08-648-100	Removes excess chloroform from lipid films
2mL Centrifuge Tube	Fisher	02682004	Used for concentrating nanodroplets