Produção de nanodroplets de decafluorobutano filtrados por membrana a partir de microbolhas pré-formadas

Resumo

Este protocolo descreve um método de geração de grandes volumes de microbolhas de decafluorobutano encapsuladas lipídicas usando sônica de ponta de sonda e, posteriormente, condensando-as em nanodroplets de mudança de fase usando extrusão de alta pressão e filtração mecânica.

Resumo

Existem muitos métodos que podem ser usados para a produção de gotículas vaporizáveis de mudança de fase para imagem e terapia. Cada método utiliza técnicas diferentes e varia em preço, materiais e propósito. Muitos desses métodos de fabricação resultam em populações polidispersas com limiares de ativação não uniformes. Além disso, controlar os tamanhos das gotículas normalmente requer líquidos perfluorocarbonos estáveis com altos limiares de ativação que não são práticos in vivo. Produzir tamanhos uniformes de gotículas usando gases de ponto de baixa ebulição seria benéfico para experimentos de imagem e terapia in vivo. Este artigo descreve um método simples e econômico para a formação de nanodroplets de mudança de fase estabilizadas lipídicas com decafluorobutano de ponto de baixa ebulição (DFB). Descreve-se um método comum de geração de microbolhas lipídicas, além de um novo método de condensação deles com extrusão de alta pressão em um único passo. Este método foi projetado para economizar tempo, maximizar a eficiência e gerar maiores volumes de soluções de microbolhas e nanodroplet para uma grande variedade de aplicações usando equipamentos de laboratório comuns encontrados em muitos laboratórios biológicos.

Introdução

Os agentes de contraste de ultrassom (UCAs) estão crescendo rapidamente em popularidade para aplicações de imagem e terapia. Os microbolhas, os UCAs originais, são atualmente os principais agentes utilizados em aplicações de diagnóstico clínico. Microbolhas são esferas cheias de gás, tipicamente de 1-10 μm de diâmetro, cercadas por conchas lipídicas, proteicas ou polímeras1. No entanto, seu tamanho e estabilidade in vivo podem limitar sua funcionalidade em muitos aplicativos. Nanodroplets de mudança de fase, que contêm um núcleo líquido superaquecido, podem superar algumas dessas limitações devido ao seu tamanho menor e à melhoria da vida útil da ^{circulação2}. Quando exposto ao calor ou à energia acústica, o núcleo líquido superaquecido vaporiza para formar um microbolhas ^de gás2,3,4,5. Uma vez que o limiar de vaporização está diretamente relacionado com o tamanho da ^gotícula5,6, formular suspensões de gotículas com tamanho uniforme seria altamente desejável para alcançar limites de ativação consistentes. Métodos de formulação que produzem tamanhos uniformes de gotículas são muitas vezes complexos e caros, enquanto abordagens mais econômicas resultam em soluções polidisperses7. Outra limitação é a capacidade de gerar gotículas de mudança de fase estáveis com gases de perfluorocarbono de ponto de baixa ebulição (PFC), o que é fundamental para uma ativação eficiente no ^vivo8. Neste manuscrito, é descrito um protocolo para gerar gotículas vaporizáveis de ponto de baixa ebulição filtradas para aplicações de imagem e terapia in vivo.

Existem muitos métodos de produção de gotículas de mudança de fase de submicron monodisperspersed7. Um dos métodos mais robustos de controle de tamanho é o uso de dispositivos microfluidos. Esses dispositivos podem ser caros, ter taxas lentas de produção de gotículas (~104-106 gotículas/s)⁷ e requerem treinamento extensivo. Dispositivos microfluidos também geralmente requerem gases de ponto de alta ebulição para evitar a vaporização espontânea e o entupimento do ^sistema7. No entanto, um estudo recente de De Gracia Lux et ^al.9 demonstra como o resfriamento de um microfluidizador pode ser usado para gerar altas concentrações de mudança de fase sub-micron (1010-1012/mL) usando decafluorobutano de ponto de baixa ebulição (DFB) ou octafluoropropano (OFP).

Em geral, gases de ponto de baixa ebulição, como DFB ou OFP, são mais fáceis de manusear usando bolhas de gás pré-formadas. Gotículas vaporizáveis podem ser produzidas a partir de bolhas precursoras estabilizadas lipídios, condensando o gás usando baixas temperaturas e pressão ^elevada5,10. A concentração de gotículas produzidas usando este método depende da concentração precursora de microbolhas e eficiência da conversão de bolhas em gotículas. Microbolhas concentradas foram relatadas a partir da sônica de ponta que se aproxima > ¹⁰¹⁰ MB/^mL11, enquanto um estudo separado relatou concentrações de gotículas que variam de ~1-3 ^x1011 gotículas/mL de bolhas condensadas OFP e ^DFP12. Quando gotículas monodisperadas não são uma preocupação, os métodos de condensação são os métodos mais simples e de menor custo de gerar gotículas de mudança de fase estabilizadas lipídicas usando PFCs de ponto de baixa ebulição. Métodos de geração de bolhas de tamanho uniforme antes da condensação podem ajudar a criar populações mais monodispersas de gotículas. No entanto, a geração de bolhas precursoras monodisperses também é difícil, exigindo abordagens mais caras, como microfluidos ou técnicas repetidas de centrifugação ^{diferencial11}. Uma abordagem alternativa para a produção de nanodroplets DFB e OFB foi publicada recentemente usando nucleação espontânea de gotículas em lipossomos13. Este método, utilizando um efeito "Ouzo", é uma maneira simples de gerar gotículas PFC de ponto de baixa ebulição sem precisar condensar bolhas. A distribuição de tamanho das gotículas PFC pode ser controlada por delicadas titulação e mistura de componentes PFC, lipídios e etanol usados para iniciar a nucleação das gotículas. Também vale a pena notar que a mistura de perfluorocarbonos pode ser usada para controlar os limiares de estabilidade e ativação de nanodroplets14,15. Trabalhos mais recentes de Shakya et al. demonstram como a ativação de nanodroplets pode ser ajustada ao emulsionar PFCs de alto ponto de ebulição dentro de um endoesqueleto de hidrocarbonetos para facilitar a nucleação heterogênea dentro do núcleo ^gotícula16, que é uma abordagem que pode ser considerada juntamente com outras formas de filtragem do tamanho de gotícula.

Uma vez formadas, gotículas de mudança de fase podem ser extrudadas após a formação para criar populações mais monodispersas. Na verdade, um protocolo semelhante ao método descrito aqui foi publicado anteriormente por Kopechek et ^al.17 usando o ponto de ebulição alto dodecofluorpentano (DDFP) como o núcleo gotícula. Os leitores que procuram usar gotículas de mudança de fase com perfluorocarbonos de ponto de alta ebulição (estáveis à temperatura ambiente) devem fazer referência ao artigo acima. Gerar e extrudar gotículas com gases de ponto de ebulição baixos, como DFB e OFP, é mais complicado e é melhor abordado pela condensação de bolhas de gás pré-formadas.

Neste protocolo, é descrito um método comum de geração de microbolhas lipídicas pré-formadas com um núcleo de gás DFB usando a sônica da ponta da sonda. Em seguida, uma extrusora comercial é usada para condensar microbolhas pré-formadas em nanodroplets de mudança de fase de submicron (Figura 1). As gotículas resultantes são então ativadas por calor e ultrassom. Este método pode produzir volumes maiores de solução de nanodroplet do que métodos convencionais de condensação com distribuições de tamanho mais estreitas sem a necessidade de dispositivos microfluidos caros. A produção de soluções de nanodroplet com distribuições de tamanho estreito pode provavelmente gerar mais limites de vaporização uniformes. Isso maximizará seu potencial para inúmeras aplicações, como imagem, ablação, entrega de medicamentos e embolização1,3,4,6.

Figura 1: Esquema de configuração de extrusão de alta pressão para condensar microbolhas pré-formadas em nanodroplets de mudança de fase. A solução de microbolhas é adicionada e contida na câmara extrusora, e 250 psi, do tanque de nitrogênio, é aplicada através da válvula de entrada da câmara. O gás nitrogênio empurrará a solução de microbolhas através do filtro na base da câmara, condensando a amostra em nanodroplets. A solução é finalmente empurrada para fora da extrusora através do tubo de saída de amostra e coletada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. Fazer filmes lipídes

1. Prepare filmes lipídeis para a geração de microbolhas usando 90% DSPC e 10% DSPE-PEG2K misturando os lipídios na razão correta usando as seguintes instruções:
   1. Faça lipídios de estoque de DSPC e DSPE-PEG2K em clorofórmio. Pesar 50 mg de cada pó lipídico em frascos separados. Adicione 1 mL de clorofórmio a cada frasco usando uma seringa de vidro de 1 mL.
   2. Adicione 287 μL de estoque DSPC e 113 μL de estoque DSPE-PEG2K (ambos 50 mg/mL) em um frasco de cintilação de 20 mL usando uma seringa de vidro.
   3. Seque os lipídios mistos para remover o clorofórmio usando nitrogênio. Usando um comprimento apropriado de tubulação conectada ao nitrogênio da casa, flua levemente gás nitrogênio sobre o espaço da cabeça do frasco durante a mistura. Continue até que nenhum clorofórmio seja observado, e o filme lipíduo restante começa a ficar branco. Use tampas de parafuso de polipropileno, cubra a amostra enquanto introduz nitrogênio no espaço para a cabeça.
   4. Coloque frascos sob vácuo durante a noite usando um desiccador de vácuo para remover qualquer clorofórmio residual. Uma fina película translúcida permanecerá que reveste a parte inferior do frasco.
   5. Armazene frascos a -20 °C até que seja necessário.

2. Gerando microbolhas de filmes lipídidos

1. Para fazer os microbolhas, adicione 10 mL de soro fisiológico tampão fosfato de 1x (PBS) contendo 20% v/v Propileno Glycol e 20% v/v Glicerol (pH final 7.2-7.4) a uma película lipídica seca.
2. Recapque a amostra e aqueça a amostra a 65 °C por 30 minutos em um bloco de aquecimento (ou banho de água aquecida).
3. Enquanto a amostra estiver aquecendo, prepare o sonicator do banho aumentando a temperatura do banho para 65 °C.
   NOTA: Este processo é mais rápido se a água estiver pré-aquecido em um micro-ondas ou placa quente antes de colocar no sonicator do banho.
4. Coloque o frasco de cintilação contendo a amostra aquecida no sônico de banho para que apenas a porção do frasco contendo a solução lipídica fique submersa no banho de água.
5. Sonicar a solução lipídica quente por um mínimo de 15 min. Certifique-se de que a temperatura da água permanece em 65 °C. Continue a sonicar em intervalos de 10-15 min até que a solução esteja completamente clara (Figura 2).
   NOTA: Se um sônico de banho não estiver disponível, a solução pode ser sônica com 10% de potência até ficar clara. No entanto, a microfina se desgastará mais rápido e é mais cara para substituir.

Figura 2: Exemplo de filmes lipídes hidratados. Exemplo de filme lipídeca hidratado (A) antes e (B) após a sônica do banho para formar vesículas uni-lamelar. Após a sônica do banho, a solução lipídica deve passar de uma solução mais opaca para translúcida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Enquanto ainda estiver quente, remova a tampa e aperte o frasco no gabinete à prova de som do sonicator para que a fixação da microtipa do sonicator fique submersa logo abaixo da interface ar/líquido (Figura 3).
7. Coloque o tanque de decafluorobutano ao lado do gabinete à prova de som do sonicator.
8. Prepare um banho de gelo e coloque-o ao lado do gabinete à prova de som. Isso será usado mais tarde na etapa 2.14.
9. Ligue o interruptor de alimentação para o sonicator.
10. Após o início do sistema, defina o nível de potência para 70%. Não exceda 70% de amplitude com o acessório de microtipo. Não inicie o sonicator neste momento.
11. Conecte um comprimento adequado de tubulação para guiar o gás da saída do tanque DFB na solução lipídica quente mantida no gabinete. O tubo deve ser colocado apenas no pescoço do frasco para permitir que o gás flua para dentro do espaço da cabeça durante a sônica (Figura 3).
12. Abra a válvula do tanque lentamente até que o gás possa ser visto fluindo sobre a solução lipídica. Isso causará pequenas ondulações na superfície do líquido. Se o fluxo de gás for muito alto, a solução transbordará durante a formulação de microbolhas.
13. Inicie o sonicator e execute por 10 s continuamente para gerar microbolhas. Se a solução de bolha começar a transbordar durante a sônica, pare imediatamente o sonicator.
14. Desligue o sonicador e feche imediatamente a válvula do tanque DFB.
15. Tampar rapidamente a solução de microbolhas e submergir o frasco no banho de gelo para resfriar a amostra abaixo de 55 °C (temperatura de transição de vidro do DSPC)
16. Deixe as amostras de microbolhas no banho de gelo até que seja necessário.

Figura 3: Colocação da ponta da sonda na solução lipídica para otimizar a formação de microbolhas. Tome cuidado para não permitir que a ponta da sonda toque no vidro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Preparação de extrusora para condensação de microbolhas

1. Monte a extrusora de alta pressão conforme detalhado no manual do usuário usando um filtro cerâmico de 200 nm (fornecido pelo fabricante).
2. Coloque a extrusora no centro de um recipiente impermeável para que o tubo de saída da amostra não seja pressionado contra o lado ou amassado.
3. Junte a extrusora ao tanque de gás nitrogênio usando o adaptador fornecido pelo fabricante.
4. Faça um banho de gelo salgado de -2 °C no recipiente impermeável ao redor da extrusora usando 400 mL de água e 10 g de cloreto de sódio.
5. Coloque a extremidade do tubo de saída em um frasco de cintilação para coletar a amostra extrudada.
   NOTA: Fixar o tubo no recipiente com fita adesiva se ele não estiver liso ou ficar dentro do frasco.

4. Escorraçando a extrusora para condensação de microbolhas

1. Abra e feche a válvula de liberação para ter certeza de que não há pressão dentro da extrusora.
2. Retire a tampa da câmara e adicione 5 mL de 1x PBS à câmara extrudora.
3. Substitua a tampa certificando-se de que ela clique com segurança de volta no lugar.
4. Abra o tanque de gás nitrogênio para que o medidor de pressão leia 250 psi. Certifique-se de que a válvula de controle de pressão está na posição fechada.
5. Feche o tanque de gasolina e abra a válvula de entrada da câmara extrusora. A solução PBS será empurrada através do sistema e para fora do tubo de saída de amostra para o frasco de cintilação.
6. Quando apenas o gás estiver saindo da tubulação, abra a válvula de liberação e deixe a pressão cair para 0 psi.
7. Remova o frasco de cintilação.

5. Microbolhas pré-resfriamento para extrusão

1. Abra e feche a válvula de liberação para ter certeza de que não há pressão dentro da extrusora. Coloque um novo frasco de cintilação no final do tubo de saída.
2. Encha um recipiente de aço com butano de 2 metila e adicione gelo seco para baixar a temperatura para -18 °C.
3. Insira a solução de microbolhas no butano de 2 metila refrigerado para que a amostra fique submersa por 2 minutos. Mova o frasco de cintilação ao longo dos 2 minutos para misturar suavemente as bolhas. Adicione gelo seco conforme necessário para manter a temperatura entre -15 e -18 °C. Tenha cuidado para não exceder -20 °C ou a solução excipiente congelará e destruirá a amostra de bolha.
   NOTA: As etapas 5.2 e 5.3 também podem ser feitas resfriando a amostra de bolha em um congelador de laboratório por um período de tempo mais prolongado. No entanto, deve-se ter cuidado para monitorar cuidadosamente a temperatura do congelador e evitar o congelamento da amostra.
4. Depois de 2 min, remova os microbolhas do butano de 2-metil refrigerado, agite suavemente o frasco para misturar as microbolhas e use uma seringa de 10 mL refrigerada para transferir a solução para a extrusora.
5. Remova a tampa da câmara de extrusora e adicione a solução de microbolhas à câmara empurrando lentamente o êmbolo sobre a seringa. Substitua a tampa da extrusora certificando-se de que ela clique com segurança de volta no lugar.
6. Verifique se a válvula de controle de pressão e a válvula de liberação da extrusora estão na posição fechada.
7. Abra o tanque de gás nitrogênio até que o medidor de pressão leia 250 psi, feche o tanque de gás e gire a válvula de controle de pressão para a posição aberta.
8. Quando a solução tiver preenchido o frasco de cintilação na tubulação de saída, e apenas o gás estiver saindo do tubo, abra lentamente a válvula de liberação de pressão e permita que a pressão caia para 0 psi.
9. Coloque o frasco de cintilação em um banho de gelo ou geladeira para armazenamento.
10. Para armazenamento a longo prazo e minimização da vaporização espontânea, armazene a amostra em um freezer padrão. Certifique-se de que a temperatura é de -20 °C ou superior para evitar o congelamento da amostra (a solução excipiente de 20% de PPG e 20% de Glicerol impedirá que a amostra congele na maioria dos freezers de laboratório).

6. Separar gotículas de lipossomos por centrifugação

1. Transfira 10 mL da solução de gotícula extrudada para um tubo centrífuga de 15 mL.
2. Centrifugar a amostra extrudada a 1.500 x g por 10 min a 4 °C. Uma pelota composta por nanodroplets DFB será aparente na parte inferior do tubo (Figura 4). Gotículas vaporizadas espontaneamente aparecerão no topo da solução e devem ser descartadas.

Figura 4: Exemplo de gotículas DFB de mudança de fase pelotas após centrifugação. As nanodroplets DFB são mais densas que lipossomos e serão coletadas na parte inferior do tubo de centrífuga em uma pelota, (caixa vermelha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Remova o supernascer e resuspenda a pelota em 2 mL de 1x PBS com 20% de glicerol e 20% de propilenoglicol.
4. Misture o tubo suavemente para obter uma solução homogênea e transfira as gotículas para um tubo de centrífuga menor de 2 mL.
5. Lave a amostra mais duas vezes no tubo de centrífugas de 2 mL.
6. Após a última lavagem, resuspenja a pelota em 100 μL de 1x PBS com 20% de glicerol e 20% de propilenoglicol e armazene no gelo ou no congelador até que seja necessário.

7. Verificação de microscopia da vaporização de gotículas

1. Faça uma solução de gotícula diluída adicionando 2,5 μl de gotículas concentradas a 7,5 μl de 1x PBS.
2. Prepare um slide de microscópio com 10 μl da amostra diluída. Usando um objetivo de 40x, observe a amostra e salve imagens.
3. Remova o slide do microscópio e coloque-o em uma placa de calor de 65 °C por 1 min para vaporizar nanodroplets em microbolhas.
4. Use o mesmo objetivo de 40x para observar a amostra após o aquecimento para verificar a vaporização de gotículas.

Resultados

Os resultados representativos da distribuição de tamanho estão incluídos utilizando a dispersão dinâmica de luz (DLS) e a análise de sensor de pulso resistivo (TRSP). A Figura 5 mostra a distribuição de tamanho das soluções de bolha condensada com e sem extrusão. Sem extrusão, o protocolo termina na etapa 5.3. As bolhas geladas são condensadas ventilando a amostra à pressão atmosférica enquanto frias. A amostra condensada só tem uma distribuição muito mais ampla centrada ...

Discussão

Está disponível um corpo abrangente de literatura que discute a formulação, física e aplicações potenciais de microbolhas e gotículas de mudança de fase para imagem e terapia in vivo. Esta discussão diz respeito explicitamente à geração de microbolhas lipídicas e à conversão em gotículas de mudança de fase sub-micron usando um baixo ponto de ebulição de gás DFB e extrusão de alta pressão. O método aqui descrito destina-se a fornecer um método relativamente simples de produzir grandes quantidades ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Centrifuge Tubes	Falcon	352095	Collecting and centrifuging droplets
200 nm polycarbonate filter	Whatman	110606	Extruder filters
2-methylbutane	Fisher Chemical	03551-4	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
3-prong clamps X2	Fisher	02-217-002	Holding scintilation vials in place for probe tip sonication
400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn	Branson	101-063-198R	Used to generate lipid microbubbles from lipid solution
Bath Sonicator	Fisher Scientific	15337402	Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles
Chloroform	Fisher Bioreagents	C298-4	Used to make lipid film for microbubble preperation
Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas	FluoroMed L.P.	1 kg	generating microbubbles via probe tip sonication
Dry Ice	-	-	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
DSPC Lipid Powder	NOF America	COATSOME MC-8080	Component of lipid film
DSPE-PEG-2K Lipid Powder	NOF America	SUNBRIGHT DSPE-020CN	Component of lipid film
General Thermometer	-	-	Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures)
Glass Syringes	Hamilton	81139	Used to mix lipids in chloroform
Glycerol	Fisher Bioreagents	BP229-1	Reduces freezing temperature of PBS solution
Heating Block	VWR Scientific Products		Heating lipid films and vaporizing droplets
Lipex 10 mL Extruder	Evonik		Commercial high-pressure extrusion system
Mini Vortex Mixer	Fisher brand	14-955-151	Used to remove excess chloroform from lipid films
Nitrogen Tank	-	-	Used to operate extruder
Phosphate Buffer Saline	Fisher Scientific		Hydrate lipid films and washing droplets
Polyester Drain Disk	Whatman	230600	Provides support for polycarbonate filter
Polypropylene Caps	Fisher Scientific	298417	Used for solution storage
Propylene Glycol	Fisher Chemical	P355-1	Reduces freezing temperature of PBS solution
Scintiliation Vials	DWK Life Sciences Wheaton	986532	Used for lipid films and microbubble generation
Small hammer	-	-	Used to break apart dry ice for cooling methylbutane
Sonicator Microtip Attachment	Branson	101148070	Used to generate microbubbles from lipid solution
Steel Container	Medegen	79310	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work)
Vacuume Dessicator	Bel-Art SP Scienceware	08-648-100	Removes excess chloroform from lipid films
2mL Centrifuge Tube	Fisher	02682004	Used for concentrating nanodroplets