超声引导诱导多能干细胞来源心肌细胞植入心肌梗死小鼠

摘要

在小鼠心肌梗死部位周围进行超声引导的细胞递送是一种安全、有效、方便的细胞移植方式。

摘要

心肌梗死（MI）后细胞治疗的主要目的是有效提高细胞移植率，人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）是缺血性损伤后心脏修复的有希望的细胞来源。然而，低移植率是移植后有效心脏组织再生的重大障碍。该协议表明，多次hiPSC-CM超声引导经皮注射到MI区域可有效提高细胞移植率。该研究还描述了整个hiPSC-CM培养过程，预处理和超声引导的经皮递送方法。此外，使用人类线粒体DNA有助于检测其他小鼠器官中hiPSC-CMs的缺失。最后，本文描述了小鼠细胞递送后4周梗死边界区心脏功能、血管生成、细胞大小和细胞凋亡的变化。可以得出结论，超声心动图引导下经皮注射左心室心肌是一种可行、侵入性相对较强、令人满意、可重复且有效的细胞治疗。

引言

当急性心肌梗死发生时，梗死区域的心肌细胞因缺血和缺氧而迅速死亡。细胞死亡和破裂后释放几种炎症因子，而炎性细胞浸润梗死部位引起炎症¹。值得注意的是，没有收缩性和导电性的成纤维细胞和胶原蛋白取代梗死部位的心肌细胞形成疤痕组织。由于成年哺乳动物心肌细胞的再生能力有限，大面积梗死后形成的活组织通常不足以维持足够的心输出量²。心肌梗死引起心力衰竭，在心力衰竭严重的情况下，患者只能依靠心脏移植或心室辅助装置来维持正常的心脏功能^3，4。

心肌梗死后，理想的治疗策略是用新形成的心肌细胞替换死亡的心肌细胞，与健康组织形成机电耦合。然而，治疗方案通常采用心肌挽救而不是替代。目前，基于干细胞和祖细胞的疗法是MI⁵后促进心肌修复的最有希望的策略之一。然而，这些细胞的移植有几个问题，主要是成体干细胞无法分化成心肌细胞并且它们的寿命短^6。

与使用胚胎干（ES）细胞相关的伦理问题可以通过iPSCs来规避，iPSCs是一种有希望的细胞来源。此外，iPSCs具有很强的自我更新能力，可以分化为心肌细胞⁷。....

研究方案

本研究所有动物实验均经中南大学湘雅二医院伦理委员会审核通过。有关本协议中使用的所有材料和设备的详细信息，请参阅 材料表 。细胞注射，成像和安乐死的时间表如下：t0-诱导梗死，t1周-成像和植入细胞，t2周-成像和植入细胞，t4周-最终成像，安乐死和组织收集。

1. hiPSC培养、心肌细胞分化和细胞纯化

1. 将DMEM / F12和基底膜基质储备溶液与冰在4°C下以1.5：1的比例等分混合，并将所得混合物（基质稀释剂）储存在-20°C。 将 25 mL DMEM/F12 培养基在 4 °C 和 1 mL 基质稀释剂与冰彻底混合，并在 6 孔板中铺展 1 mL/孔。将板在37°C的培养箱中直立1小时，并从孔中吸出DMEM / F12上清液。执行该程序时，请勿触摸6孔板的底部。
2. 从液氮中取出含有hiPSC的冷冻保存管，并在37°C水浴中快速解冻。用75%的酒精对冷冻保存管的外表面进行消毒，擦去酒精，然后将管子转移到无菌超洁净台上。
3. 使用移液管将含有hiPSCs的冷冻保存溶液轻轻转移到15 mL离心管中，加入5 mL无饲养层ES培养基，并在室温下以300 × g 离心悬浮液3分钟。弃去上清液并将细胞轻轻重悬于 6 mL 无饲养层 ES 培养基中。计数细胞并用培养基将细胞浓度调节至5×10⁵ 细胞/ mL。
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结果

用于评估每组小鼠左心室功能的超声心动图显示，MD组的MI损伤有效逆转（图2A）。与MI组相比，SD组的射血分数（EF）增加（从30%增加到35%; 图2B）和分数缩短（FS）（从18%增加到22%; 图2C）在MI之后。然而，更值得注意的是，在MD组小鼠中多次注射hiPSC-CMs经皮增加了EF（从30%增加到42%; 图2B）和满量程（从18%降至28.......

讨论

本研究的关键步骤包括hiPSC培养，心肌细胞分化，hiPSC-CM纯化和hiPSC-CM移植到小鼠心肌梗死部位。关键是使用心脏超声经皮引导治疗到梗死边缘的梗死部位，在那里将hiPSC-CMs注射到该区域。

随着培养时间的延长，hiPSC-CM表型在形态（较大的细胞大小）、结构（肌肉、原纤维密度、排列、微观细胞簇）和生理（钙处理和β-肾上腺素能反应）上随时间变化。本研究在hiPSC分化为心肌?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Cardiac troponin T	Abcam	ab8295
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150105
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 555)	Abcam	ab150110
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150073
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555)	Abcam	ab150062
Human cardiac troponin T	Abcam	ab91605
Isolectin B4	Vector	FL-1201
Sarcomeric alpha actinin	Abcam	ab9465
Wheat germ agglutinin	Thermo Fisher Scientific	W11261
Reagent
Accutase	Thermo Fisher Scientific	00-4555-56
B27 Supplement(minus insulin)	Thermo Fisher Scientific	A1895601
B27 Supplement(serum free)	Thermo Fisher Scientific	17–504-044
Bouin's solution	Thermo Fisher Scientific	SDHT10132
CHIR99021	Selleck	CT99021
cyclosporin A	Medchemexpress	HY-B0579
DIRECT RED	Sigma-Aldrich	365548-25G
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320033
DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69504
FAST GREEN FCF	Sigma-Aldrich	F7252-5G
Glucose-free RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11879020
IWR1	Selleck	S7086
lactic acid	Sigma-Aldrich	L6661
Matrigel	BD Biosciences	BD356234
mTeSR1	Stem Cell Technologies	72562
O.C.T. Compound	SAKURA	4583
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PowerUP SYBR Green MasterMix kit	Thermo Fisher Scientific	A25742
RPMI1640	Thermo Fisher Scientific	11875119
STEMdif Cardiomyocyte Freezing Medium/STEMdiff	Stem Cell Technologies	5030
STEMdiff Cardiomyocyte Support Medium	Stem Cell Technologies	5027
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
ultrasound coupling agent	CARENT	22396269389
Y-27632	Selleck	S6390
Equipment and Supplies
Applied Biosystems	Thermo Fisher Scientific	7500 Real-Time PCR
cryostat	Leica	CM1950
fluoresence microscope	Olympus	IX83
fine anatomical scissors	Fine Science Tools	15000-08
fine dissecting forceps	Fine Science Tools	11255-20
Micro syringe	Hamilton	7633
Small animal anesthesia machine	MATRX	VMR
Ultra-high resolution small animal ultrasound imaging system	VisualSonics	Vevo 2100
Software
Statistical Product and Service Solutions	IBM	21
Image J	NIH	1.48
Human mitochondrial DNA primers
the forward primer sequence	CCGCTACCATAATCATCGCTAT
the reverse primer sequence	TGCTAATACAATGCCAGTCAGG