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用肌内脂肪代替健康的肌肉组织是人类疾病和病症的突出特征。该协议概述了如何可视化,成像和量化肌内脂肪,从而可以严格研究肌内脂肪形成的机制。
纤维脂肪源性祖细胞(FAPs)是间充质基质细胞,在骨骼肌稳态和再生过程中起关键作用。FAPs构建和维护充当分子肌纤维支架的细胞外基质。此外,FAPs对于肌纤维再生是必不可少的,因为它们分泌肌肉干细胞(MuSC)感知的多种有益因子。然而,在患病状态下,FAPs是肌内脂肪和纤维化瘢痕组织的细胞起源。这种脂肪纤维化是肌肉减少症和神经肌肉疾病(如杜氏肌营养不良症)的标志。确定FAPs分化为肌内脂肪的原因和方式的一个重要障碍是脂肪细胞的有效保存和随后的可视化,特别是在冷冻组织切片中。传统的骨骼肌组织处理方法,如速冻,不能正确保存单个脂肪细胞的形态,从而阻止准确的可视化和定量。为了克服这一障碍,开发了一种严格的方案,保留了骨骼肌切片中的脂肪细胞形态,允许肌肉内脂肪的可视化,成像和定量。该协议还概述了如何处理RT-qPCR的肌肉组织的一部分,使用户能够通过观察脂肪生成基因表达的差异来确认观察到的脂肪形成变化。此外,它可以通过肌肉样品的全载免疫荧光来可视化脂肪细胞。最后,该协议概述了如何对表达 Pdgfrα的FAPs进行遗传谱系示踪,以研究FAPs的脂肪转化。该协议始终如一地产生脂肪细胞的高分辨率和形态学上准确的免疫荧光图像,以及RT-qPCR的确认,允许对肌内脂肪进行稳健,严格和可重复的可视化和定量。总之,这里描述的分析管道是提高我们对FAPs如何分化成肌内脂肪的理解的第一步,并为验证防止脂肪形成的新干预措施提供了一个框架。
脂肪纤维化对健康肌肉组织的浸润是杜氏肌营养不良症(DMD)和其他神经肌肉疾病,以及肌肉减少症,肥胖症和糖尿病的显着特征1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.虽然在这些情况下脂肪浸润增加与肌肉功能下降密切相关,但我们对肌内脂肪形成的原因和方式的了解仍然有限。FAPs是一种多能的间充质基质细胞群,存在于大多数成人器官中,包括骨骼肌11,12。然而,随着年龄的增长和慢性疾病,FAPs产生纤维化瘢痕组织并分化成脂肪细胞,其位于单个肌纤维之间并形成肌内脂肪13,14,15,16,17,18,19,20。
为了开始对抗肌内脂肪的形成,需要定义FAPs如何变成脂肪细胞的机制。PDGFRα是该领域识别肌肉内FAPs的"金标准"标记13,16,17,18,20,21,22,23,24,25,26,27。结果,在Pdgfrα前驱体的控制下,已经产生了几种小鼠他莫昔芬诱导的Cre系,允许使用Cre-LoxP系统27,28,29在体内遗传操纵FAPs。例如,通过将这种可诱导的Cre谱系与遗传报告基因相结合,可以执行FAPs的谱系追踪,我们已经成功地将这种策略应用于肌肉和白色脂肪组织中的命运映射FAPs20,30。除了谱系追踪之外,这些Cre品系还为研究FAP到脂肪的转化提供了有价值的工具。
定义FAPs脂肪转化为肌内脂肪的机制的一个主要障碍是能够严格和可重复地量化在不同条件下形成的肌内脂肪量。关键是平衡肌肉和脂肪组织的保存,并将其与可用的染色方法相匹配,以可视化脂肪细胞。例如,骨骼肌通常在没有事先固定的情况下被速冻,保留肌纤维但破坏脂肪细胞形态(图1)。相反,固定后进行石蜡包埋,同时显示最佳的组织组织学,包括脂肪细胞,去除所有脂质,从而使大多数亲脂性染料(例如常用的染料油红O)无法使用。
图1:速冻肌肉组织中肌内脂肪与固定肌肉组织中的代表性图像。免疫荧光图像显示甘油损伤后21天(B)速冻和(C)固定TA内的脂肪细胞(黄色),肌纤维(灰色)和细胞核(青色)。比例尺:50 μm.请点击此处查看此图的大图。
这里描述的方案保留了肌纤维和脂肪细胞的形态,并允许可视化和分析多种细胞类型。该方法基于多聚甲醛(PFA)固定肌肉组织中脂肪细胞的免疫荧光染色,允许与多种抗体共染色。它还可以很容易地适应于使用全安装成像在完整组织中的空间显示肌内脂肪,从而提供有关肌肉内脂肪的细胞微环境的信息。此外,该协议可以与我们最近发表的方法相结合,以确定固定肌肉组织31中肌纤维的横截面积,这是评估肌肉健康的重要测量。本文还概述了将这种方法与遗传谱系追踪相结合,以绘制FAPs分化为脂肪细胞的命运图谱。因此,这里描述的多功能方案能够对FAPs及其在组织切片和完整组织中分化为肌内脂肪进行严格且可重复的评估。
图 2:协议概述示意图。 组织处理的示意图概述,其中三分之一的TA被去除,快速冷冻和匀浆,以便 随后通过 RT-qPCR进行RNA分离和转录分析。另外三分之二的TA是PFA固定的,并经过加工,用于对冷冻切片或全纤维进行免疫染色。 请点击此处查看此图的大图。
所有动物协议均由佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。
1. FAPs的遗传谱系追踪
注意:如果不需要 FAP 的遗传谱系追踪,则可以跳过步骤 1。
2. 胫骨前肌(TA)损伤
注意:为了研究肌内脂肪,建议使用基于甘油的损伤模型(无菌盐水中的甘油为50%),这导致大量的肌内脂肪形成34,35,36,37。
3. 组织采集
图3:组织收获摘要 (A)皮肤在腿部底部被切开,(B)后肢肌肉暴露在外。(C)一旦从TA中去除表皮,(D)镊子用于部分分离肌肉并确保表膜已被完全去除。(E)TA用手术刀从腿上切下,并在切除肌腱后取出。(G)将TA切割成三分之一和三分之二的碎片后,(H)三分之一在液氮中速冻以进行RT-qPCR分析,(I)另外三分之二固定在4%PFA中以进行组织学检查。 请点击此处查看此图的大图。
4. 嵌入
5. 切片
6. 组织切片的免疫荧光(IF)染色
注意:由于抗体浓度可能因批次和制造商而异,因此建议在染色目标载玻片之前,在测试载玻片上评估几种不同浓度的抗体,从而进行优化。
7. 全贴片免疫荧光染色
8. 肌内脂肪的成像
9. 量化脂肪细胞
10. 使用逆转录-qPCR进行脂肪生成基因表达分析
肌内脂肪的免疫荧光可视化
按照上述步骤并查看图1A,从甘油损伤后21天收集TA组织切片,这些切片要么在LN2冷却的异戊烷中收获后立即速冻,要么在4%PFA中固定2.5小时。在冷冻切片和染色两个样品后,在TA的最大区域腹部中部拍摄图像。与固定切片(图1C)相比,来自未固定的TA的PERILIPIN+脂肪细胞(图1B)显着改变了形态,使其鉴定,可视化和随后的定量更加困难且可能不准确。需要注意的是,在损伤后约5天检测到第一个PERILIPIN +脂质液滴,大多数脂肪细胞在第7天形成。到受伤后21天,脂肪细胞已经完全成熟。
由于每TA的脂肪量与诱导损伤的严重程度密切相关,因此TA必须严重受损才能有效地观察和研究肌内脂肪的形成。使用墨水练习注射尸体TA是改善损伤严重程度的好方法。成功的损伤往往超过肌肉的50%。需要注意的是,肌肉的受伤区域表示没有肌肉纤维的区域或由肌肉纤维填充的区域,这些肌肉纤维包含至少一个位于中央的细胞核,这是再生肌肉纤维的已知标志。
该方案可以很容易地适应于3D中FAP和脂肪的染色。为此,从TA固定后小心地分离出多个肌纤维,然后进行全载免疫荧光。关键是要将纤维正确固定在载玻片上,同时避免组织过度压缩。通过使用可模塑的粘土脚,用户可以调整所需的厚度并将盖玻片固定在载玻片上,甚至允许使用倒置显微镜(图4A)。该方法成功用于标记PDGFRα + FAPs,鬼笔蛋白+ 肌纤维和表达PERILIPIN的脂肪细胞(图4B,补充视频1和补充视频2)。在获得厚度高达150μm的多个z平面上的图像后,显微镜软件中的3D渲染模块用于创建3D重建。
图 4:全贴片免疫荧光染色 (A) 如何安装样品并添加盖玻片进行全载染色的顶视图和侧视图。(B)FAPs(绿色,左)和脂肪细胞(红色,右)以及肌纤维(灰色)和细胞核(蓝色)的代表性3D重建。比例尺:50 μm.请点击此处查看此图的大图。
肌内脂肪的定量
一旦拍摄了肌内脂肪的图像,ImageJ / FIJI中的细胞计数器功能用于手动计数PERLIPIN + 脂肪细胞的数量(图5A)。接下来,确定肌肉部分的总面积以及受伤区域,由肌纤维内位于中央的核定义。为了控制损伤的严重程度,将脂肪细胞的总数除以受伤区域,从而产生每1mm2 受伤肌肉的脂肪细胞数量。通常,显示<30%损伤的TA被排除在量化之外。需要注意的是,尽管脂肪细胞在没有损伤的情况下很少见,每个横截面积从零到八不等,但脂肪细胞的总数仍然按总面积归一化。如图 5B所示,与未受伤的TA肌肉相比,甘油损伤会导致大量的肌内脂肪。或者,由于佩里利平染色非常干净,信噪比高,因此也可以使用 分析颗粒 功能来确定佩里利平所占据的总面积。然而,这种方法将无法区分较小的脂肪细胞与较少的脂肪细胞。对至少四只个体动物的多达三个部分进行成像和定量,并报告了每只小鼠存在的脂肪细胞的平均数量。
图5:肌内脂肪的定量 (A)如何使用ImageJ中的细胞计数器功能计数PERILIPIN + 脂肪细胞(白色)的代表性图像。比例尺:50μm.(B)全TA脂肪细胞定量后甘油注射后21天归一化至受伤区域的1mm 2 。每个点表示一个鼠标的平均值。误差线显示为 SEM. **** = p < 0.0001。(C)匀浆后的RNA层以及随后通过氯仿相分离后用于RT-qPCR分析。(D)在甘油损伤后的不同时间点, 折叠Pparg 和 Cepbα,早期脂肪生成基因以及 Plin1 和 Adipoq( 两个成熟的脂肪细胞标记物)表达水平的变化。每个点表示一个鼠标的平均值。误差线显示为SEM .请单击此处查看此图的大图。
为了独立确认肌内脂肪的存在量,可以确定各种脂肪形成标志物的基因表达水平。为此,RNA可以在损伤后的不同点从用于免疫荧光的同一TA肌肉的一部分分离(参见上面的步骤)。将磁珠打浆器与硫氰酸镧结合使用以匀化组织。加入氯仿然后离心后,仔细提取上部含RNA层,并使用迷你离心柱进行RNA纯化(图5C)。该方法通常产生高质量和数量的RNA,适用于所有下游分析,如RT-qPCR和RNAseq。对于RT-qPCR,确定了内务层基因脂肪原的相对表达水平,并按照ΔΔCT方法38评估了任何相对变化。如图5D所述,与未受伤的TA肌肉相比,甘油损伤在损伤后3天诱导早期脂肪形成标志物如Pparg和Cebpα的表达。成熟的标志物,如脂联素(Adipoq)和佩里利平(Plin1),最早可以在甘油损伤后5天检测到。
脂肪细胞的遗传谱系追踪
这里介绍的脂肪细胞染色方案可以很容易地适应,包括FAPs的遗传谱系追踪,以映射和跟踪它们的命运进入脂肪细胞。例如,我们之前已经证明,重组可以通过在PdgfrαCreERT2中通过他莫昔芬给药诱导;Rosa26EYFP小鼠在损伤前2周,有效地去除了絮凝的停止编码并不可磨灭地激活了FAPs中的EYFP表达(图6A)。我们在这里介绍的他莫昔芬方案实现了高重组效率,约75%的PDGFRα +FAPs表达EYFP20,类似于其他实验室报告的27,39,40。证明FAPs确实是肌内脂肪的细胞来源,大多数FAPs在甘油损伤后7天变成了表达EYFP +佩里利平的脂肪细胞(图6B)。
图 6:FAP 的谱系追踪 (A) 实验装置的示意图概述。(B)具有代表性的免疫荧光图像,显示PDGFRα +FAPs(红色,箭头)和佩里利平+脂肪细胞(红色,星号)内EYFP(黄色)的成功重组和活化。比例尺:25 μm.请点击此处查看此图的大图。
检测多种细胞类型
该方案也可用于可视化致肌区室。使用针对PAX7和MYOD1的抗体,肌肉干细胞(MuSCs)和肌母细胞分别可以在甘油损伤后5天轻松检测到,即使在PFA固定的肌肉组织切片中也是如此(图7)。因此,所提出的方案是多功能的,不仅适用于脂肪细胞和FAP的标记和图像,而且适用于肌源谱系的其他细胞类型。
图7:肌肉干细胞和肌母细胞免疫荧光染色。(B)具有代表性的免疫荧光图像,显示用PAX7对肌肉干细胞(MuSC)(黄色,左)和用MYOD1对成肌细胞(黄色,右)进行成功染色。层粘连蛋白勾勒出肌纤维(白色),细胞核为青色。比例尺:50 μm.请点击此处查看此图的大图。
补充视频 1:FAP 的 3D 渲染。 损伤后 21 天分别对肌纤维、FAPs 和细胞核进行三维重建,分别染色为鬼瘠苷(灰色)、PDGFRα(绿色)和 DAPI(蓝色)。 请按此下载此影片。
补充视频2:肌内脂肪的3D渲染。 肌纤维束(灰臼)和肌内脂肪(红色,PERILIPIN)的体积渲染,其在甘油损伤后21天取代了肌纤维。 请按此下载此影片。
该协议概述了一个广泛而详细的协议,允许对肌内脂肪进行有效的可视化和严格的定量。通过将同一肌肉分成两部分,一部分用于免疫荧光,另一部分用于RT-qPCR分析,该方案也非常通用。它还可以与FAPs的遗传谱系追踪相结合,以研究它们在某些条件下转化为脂肪细胞,并且高度适应于标记和成像多种其他细胞类型。
可视化肌内脂肪最常用的方法是石蜡切片,然后是苏木精和曙红染色或冷冻切片,用于亲脂性染料(如油红O(ORO))。然而,虽然石蜡处理的组织保持最佳的组织学,但相同的过程也提取所有脂质,防止使用亲脂性染料。虽然亲脂染色方法对PFA固定和未固定的组织切片都有效,但脂质液滴很容易通过对盖玻片施加压力而移位,从而扭曲肌内脂肪的空间分布。为了避免这种情况,最近的一项研究建立了一个严格的方案,使用全装载方法可视化ORO +脂肪细胞。为此,作者将TA去细胞化,以可视化整个TA41中肌内脂肪的空间分布。尽管这种技术功能强大,但它也可以防止使用其他共染色剂来标记其他细胞结构。这里介绍的整个免疫荧光方法可用于将脂肪细胞与各种标记物共染色,从而可以精细地映射细胞环境。然而,一个主要挑战是抗体的组织渗透。保持在一起的纤维越多,抗体就越难以均匀地穿透和结合所有可用的抗原。因此,当观察小组纤维时,这种方法是最有效的。同时,这也是一个限制,因为当只关注小的,剥离的纤维束时,肌内脂肪的整体解剖位置正在丢失。然而,随着目前新型组织清除方法和新的成像技术的发展,在未来42,43,44中将有可能实现更大的组织渗透和可视化。
虽然先前的肌肉组织固定保留了脂肪细胞的形态,但它也给评估肌纤维的大小带来了挑战,肌纤维是肌肉健康的重要衡量标准。肌纤维大小是通过测量肌纤维的横截面积来确定的。我们之前已经报道过,先前对肌肉组织的固定将导致大多数可用于轮廓肌纤维的标志物失效31。为了克服这一障碍,我们开发了一种新颖的图像分割管道,即使在固定的肌肉部分31中也可以测量肌纤维的大小。因此,我们已经建立了一个强大而高效的组织处理管道,与该协议相结合,克服了先前固定肌肉组织引起的大多数缺点。
这种方法的另一个主要优点是多功能性。通过将TA分成两部分,可以从一块肌肉获得的信息量最大化。这不仅减少了动物数量,而且还通过基因表达确认组织学,从而增加了额外的控制层,反之亦然。此外,除了脂肪生成基因之外,还可以检查许多不同的基因。分离的RNA也可用于整个肌肉RNA酶实验。最后,速冻肌肉块也可用于蛋白质工作。该协议的一个限制是损伤在整个TA长度上不一致的可能性。这可能导致两个肌肉部位在它们所含的肌内脂肪量上出现差异的情况,并且可能需要从任何下游分析中排除此类样本。因此,建议不要简单地依靠RT-qPCR来得出关于肌内脂肪量的主要结论,而是作为组织学定量的支持数据。
总之,该协议概述了一个强大,高效和严格的组织处理管道,该管道将允许肌内脂肪的可视化和定量,这是开发对抗脂肪纤维化的新治疗方案的第一步。同时,它是多功能的,可以适应肌肉内的许多不同细胞类型以及其他组织中的脂肪细胞。
作者声明没有竞争利益。
我们感谢Kopinke实验室的成员帮助收集数据并批判性地阅读手稿。我们还感谢佛罗里达大学真菌研究所的成员对手稿的宝贵意见。这项工作得到了NIH拨款1R01AR079449的支持。图 2 是使用生物渲染器创建的。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
16% PFA (Pack of 12, 10 mL bottles) | Electron Miscroscopy Sciences | 15710 | |
2.0 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-138 | microcentrifuge tubes for snapfreezing/bead beating |
2-Methylbutane (4 L) | Fisher Chemical | O3551-4 | isopentane |
Absolute Ethanol (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818100 | |
AffiniPure Fab fragment donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | mouse-on-mouse blocking |
Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A21206 | |
Alexa Fluor 568 donkey anti-goat secondary antibody | Invitrogen | A11057 | |
Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11037 | |
Alexa Fluor 568 Phalloidin antibody | Invitrogen | A12380 | Dissolved in 1.5 mL methanol (~66 µM working solution) |
BioLite 24-well Multidishes | ThermoFisher Scientific | 930186 | 24 well plate for PFA tissue incubation |
Biometra TOne | analytikjena | 8462070301 | Thermal cycler |
Chicken anti-GFP antibody | Aves Labs | GFP-1020 | |
Chloroform/isoamyl alcohol 24:1(v/v) for molecular biology, DNAse, RNAse, and Protease free | ThermoFisher Scientific | AC327155000 | |
Corn oil | Sigma Aldrich | C8267 | |
DAPI stain | Invitrogen | D1306 | 150 µM working solution in dH2O |
Donkey Serum (100 mL) | Millipore Sigma | 5058837 | for blocking solution |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | sharp-tipped tweezers |
Fine Scissors Straight 9 cm | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | mounting medium |
Glycerol, 99.5%, for molecular biology (500 mL) | Acros Organics | 327255000 | |
Goat anti-PDGFRα antibody | R&D | AF1062 | |
Hybridization Oven | VWR | 230301V | for Tamoxifen incubation |
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | hydrophobic pen |
Insulin Syringe with Micro-Fine IV needle (28 G) | BD | 329461 | |
Insulin Syringe with Slip Tip, 1 mL | BD | 329654 | Insulin syringe without needle, for oral gavaging |
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 78938441 | |
Leica DMi8 inverted microscope | Leica | micrscope used for widefield IF and confocal imaging | |
Micro Slides | VWR | 48311-703 | positively charged microscope slides |
mouse anti-MYOD antibody | Invitrogen | MA1-41017 | |
mouse anti-PAX7 antibody (supernatant) | DSHB | AB 428528 | |
MX35 Premier+ Microtome blades | ThermoFisher Scientific | 3052835 | microtome blades |
NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND2000 | spectrophotometer for RNA yield |
Play-Doh | Hasbro | modeling compound | |
PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher Scientific | A25742 | green dye PCR master mix |
Puralube Vet Ointment | Puralube | 17033-211-38 | vet ophthalmic ointment |
QuantStudi 6 Flex Real-Time 384-well PCR System | Applied Biosystems | 4485694 | qPCR machine |
Rabbit anti-perilipin antibody | Cell Signaling Technology | 9349S | |
Red-Rotor Shaker | Hoefer Scientific | PR70-115V | shaker for IF staining |
Richard-Allan Scientific Slip-Rite Cover Glass | ThermoFisher Scientific | 152460 | coverslips |
RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | contains mini spin columns |
Safe-Lock Tubes 1.5 ml, natural | Eppendorf | 22363204 | |
Sample Tubes RB (2 mL) | QIAGEN | 990381 | |
Sodium azide | Alfa Aesar | 14314 | |
Stainless Steel Beads, 2.8 mm | Precellys | KT03961-1-101.BK | small beads |
Stainless Steel Beads, 5 mm | QIAGEN | 69989 | medium beads |
Stainless Steel Beads, 7 mm | QIAGEN | 69990 | large beads |
Stainless Steel Disposable Scalpels | Miltex | 327-4102 | scalpel |
Stainless steel feeding tube, 20 G x 38 mm, straight | Instech Laboratories | FTSS-20S-3 | gavage needle |
Tamoxifen | Toronto Research Chemicals | T006000 | |
Tissue Plus O.C.T. Compound | Fisher HealthCare | 4585 | embedding medium |
TissueLyser LT | QIAGEN | 85600 | bead beater |
TissueLyser LT Adapter, 12-Tube | QIAGEN | 69980 | |
Tissue-Tek Cryomold | Sakura | 4566 | specimen molds |
Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | guanidium thiocyanate |
Tween20 (500 mL) | Fisher BioReagents | BP337-500 | |
VWR Micro Slides - Superfrost Plus | VWR | 48311703 | |
Wheaton Coplin staining jars | Millipore Sigma | S6016 | Coplin jar |
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