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A substituição do tecido muscular saudável por gordura intramuscular é uma característica proeminente das doenças e condições humanas. Este protocolo descreve como visualizar, imagem e quantificar a gordura intramuscular, permitindo o estudo rigoroso dos mecanismos subjacentes à formação de gordura intramuscular.
Progenitores fibro-adipogênicos (FAPs) são células mesenquimais estromicas que desempenham um papel crucial durante a homeostase e regeneração muscular esquelética. As FAPs constroem e mantêm a matriz extracelular que age como um andaime molecular de miofibra. Além disso, os FAPs são indispensáveis para a regeneração da miofibra, pois secretam uma infinidade de fatores benéficos sentidos pelas células-tronco musculares (MuSCs). Em estados doentes, no entanto, as FAPs são a origem celular da gordura intramuscular e do tecido cicatricial. Esta fibrose gordurosa é uma marca registrada de sarcopenia e doenças neuromusculares, como distrofia muscular de Duchenne. Uma barreira significativa na determinação do porquê e como as FAPs se diferenciam em gordura intramuscular é a preservação efetiva e posterior visualização de adipócitos, especialmente em seções de tecido congelado. Métodos convencionais de processamento do tecido muscular esquelético, como o congelamento de snaps, não preservam adequadamente a morfologia dos adipócitos individuais, impedindo assim a visualização e quantificação precisas. Para superar esse obstáculo, foi desenvolvido um protocolo rigoroso que preserva a morfologia adipócito em seções musculares esqueléticas que permitem visualização, imagem e quantificação de gordura intramuscular. O protocolo também descreve como processar uma porção de tecido muscular para RT-qPCR, permitindo que os usuários confirmem alterações observadas na formação de gordura, visualizando diferenças na expressão de genes adipogênicos. Além disso, pode ser adaptado para visualizar adipócitos por imunofluorescência de montagem total de amostras musculares. Finalmente, este protocolo descreve como realizar o rastreamento de linhagem genética de FAPs que expressam Pdgfrα para estudar a conversão adipogênica de FAPs. Este protocolo produz consistentemente imagens imunofluorescentes de alta resolução e morfologicamente precisas de adipócitos, juntamente com a confirmação pelo RT-qPCR, permitindo uma visualização e quantificação robusta, rigorosa e reprodutível de gordura intramuscular. Juntos, o pipeline de análise descrito aqui é o primeiro passo para melhorar nossa compreensão de como as FAPs se diferenciam em gordura intramuscular, e fornece uma estrutura para validar novas intervenções para prevenir a formação de gordura.
A infiltração de tecido muscular saudável com fibrose gordurosa é uma característica proeminente da Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) e outras doenças neuromusculares, bem como sarcopenia, obesidade e diabetes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Embora o aumento da infiltração de gordura nessas condições esteja fortemente associado à diminuição da função muscular, nosso conhecimento sobre o porquê e como as formas de gordura intramuscular ainda são limitadas. Os FAPs são uma população multipotente de células estromal mesenquimais presentes na maioria dos órgãos adultos, incluindo músculo esquelético11,12. Com a idade e as doenças crônicas, no entanto, as FAPs produzem tecido cicatricial fibroso e diferenciam-se em adipócitos, que estão localizados entre os miofibers individuais e formam gordura intramuscular 13,14,15,16,17,18,19,20.
Para começar a combater a formação de gordura intramuscular, os mecanismos de como as FAPs se transformam em adipócitos precisam ser definidos. PDGFRα é o marcador "padrão-ouro" no campo para identificar FAPs dentro do músculo de múltiplas espécies 13,16,17,18,20,21,22,23,24,25,26,27. Como resultado, várias linhas cre indutíveis de tamoxifeno murine, sob o controle do promotor Pdgfrα, foram geradas, permitindo a manipulação genética de FAPs in vivo usando o sistema Cre-LoxP 27,28,29. Por exemplo, combinando esta linha de Cre indutível com um repórter genético, o rastreamento de linhagem de FAPs pode ser realizado, uma estratégia que aplicamos com sucesso ao mapa do destino FAPs em tecido adiposo muscular e branco20,30. Além do rastreamento de linhagem, essas linhas Cre fornecem ferramentas valiosas para estudar a conversão FAP-para-gordura.
Um grande obstáculo na definição do mecanismo da conversão adipogênica das FAPs em gordura intramuscular é a capacidade de quantificar rigorosamente e reprodutivelmente a quantidade de gordura intramuscular que se formou em diferentes condições. A chave é equilibrar a preservação do tecido muscular e adiposo e combinar isso com os métodos de coloração disponíveis para visualizar adipócitos. Por exemplo, o músculo esquelético é muitas vezes congelado sem fixação prévia, preservando miofibers, mas interrompendo a morfologia adipócito (Figura 1). Em contraste, a fixação seguida de incorporação de parafina, enquanto exibe a melhor histologia tecidual, incluindo adipócitos, remove todos os lipídios, tornando assim a maioria dos corantes lipofílicos, como o corante comumente usado Oil Red O, inutilizável.
Figura 1: Imagens representativas de gordura intramuscular em tecidos musculares congelados e fixos. (A) Visão geral esquemática da configuração experimental. Imagens imunofluorescentes que mostram adipócitos (amarelo), miofibers (cinza) e núcleos (ciano) dentro de ambos (B) snap-frozen e (C) fixaram TAs em 21 dias após lesão glicerol. Barras de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O protocolo aqui descrito preserva a morfologia da miofibra e adipócito e permite a visualização e análise de múltiplos tipos de células. Esta abordagem baseia-se na coloração de imunofluorescência de adipócitos em tecido muscular fixo paraformaldeído (PFA), que permite a co-coloração com múltiplos anticorpos. Também pode ser facilmente adaptado para exibir espacialmente gordura intramuscular em tecido intacto usando imagens de montagem total, fornecendo assim informações sobre o microambiente celular de gordura dentro do músculo. Além disso, este protocolo pode ser combinado com nossa abordagem recentemente publicada para determinar a área transversal de miofibers em tecidos musculares fixos31, uma medida importante para avaliar a saúde muscular. Combinando essa abordagem com o rastreamento de linhagem genética ao mapa do destino, a diferenciação das FAPs em adipócitos também é descrita aqui. Assim, o protocolo versátil aqui descrito permite uma avaliação rigorosa e reprodutível das FAPs e sua diferenciação em gordura intramuscular em seções teciduais e tecidos intactos.
Figura 2: Visão geral do protocolo esquemático. Visão geral esquemática do processamento de tecidos em que um terço do TA é removido, congelado por snap e homogeneizado para análise subsequente de isolamento e transcrição do RNA via RT-qPCR. Os outros dois terços do TA são fixos e processados por PFA para imunossuagem em seções congeladas ou fibras de montagem inteira. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Todos os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Flórida.
1. Rastreamento de linhagem genética de FAPs
NOTA: Se o rastreamento de linhagem genética de FAPs não for desejado, o passo 1 pode ser ignorado.
2. Lesão do músculo tibialis anterior (TA)
NOTA: Para estudar a gordura intramuscular, recomenda-se o uso de um modelo de lesão à base de glicerol (50% de glicerol em soro fisiológico estéril), o que resulta em formação maciça de gordura intramuscular 34,35,36,37.
3. Colheita de tecidos
Figura 3: Resumo da colheita de tecidos. (A) A pele é cortada na base da perna e (B) os músculos do membro traseiro estão expostos. (C) Uma vez que o epimísio é removido do TA, (D) fórceps são usados para separar parcialmente o músculo e garantir que o epimísio tenha sido removido completamente. (E) O TA é cortado da perna com um bisturi e removido após cortar o tendão. (G) Depois de cortar o TA em uma peça de um terço e dois terços, (H) um terço é snap-congelado em nitrogênio líquido para análise rt-qPCR e (I) o outro dois terços é fixado em 4% PFA para histologia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Incorporação
5. Secção
6. Mancha imunofluorescente (IF) de seções teciduais
NOTA: Como as concentrações de anticorpos podem variar entre lotes e fabricantes, a otimização é recomendada avaliando várias concentrações diferentes dos anticorpos em lâminas de teste antes de colorer os slides de interesse.
7. Coloração imunofluorescente de montagem inteira
8. Imagem de gordura intramuscular
9. Quantificando adipócitos
10. Análise da expressão genética adipogênica usando RT-qPCR
Visualização imunofluorescente de gordura intramuscular
Seguindo os passos acima e vendo a Figura 1A, as seções de tecido TA foram coletadas a partir de uma lesão pós glicerol de 21 dias que foram congeladas imediatamente após a colheita em isopentane resfriada em LN2 ou foram fixadas em 4% pfa por 2,5 h. Após a crioseção e coloração de ambas as amostras, as imagens foram tiradas no meio da barriga, a maior área do TA. Os adipócitos PERILIPIN+ dos TAs não fixados (Figura 1B) alteraram significativamente a morfologia em comparação com as seções fixas (Figura 1C), tornando sua identificação, visualização e quantificação subsequente muito mais difíceis e potencialmente imprecisas. Para notar, as primeiras gotículas lipídicas PERILIPIN+ foram detectadas em torno de 5 dias após a lesão, com a maioria dos adipócitos tendo se formado até o dia 7. Por 21 dias após a lesão, os adipócitos tinham amadurecido completamente.
Como a quantidade de gordura por TA se correlaciona fortemente com a gravidade da lesão induzida, os TAs devem ser feridos significativamente para observar e estudar efetivamente a formação de gordura intramuscular. Praticar injeções usando tinta em TAs de cadáver é uma ótima maneira de melhorar a gravidade da lesão. Lesões bem sucedidas tendem a ser acima de 50% do músculo. Note-se que as áreas lesionadas do músculo representam áreas desprovidas de fibras musculares ou áreas que são povoadas por fibras musculares que contêm pelo menos um núcleo localizado centralmente, uma marca conhecida de uma fibra muscular regeneradora.
Este protocolo pode ser prontamente adaptado à mancha para FAPs e gordura em 3D. Para isso, vários miofibers da pós-fixação do TA foram cuidadosamente separados, seguidos por imunofluorescência de montagem total. A chave é fixar adequadamente as fibras na lâmina de vidro e, ao mesmo tempo, evitar a super-compressão do tecido. Usando pés de argila moldáveis, o usuário pode ajustar a espessura necessária e fixar a mancha de cobertura no slide, permitindo até mesmo o uso de um microscópio invertido (Figura 4A). Este método foi usado com sucesso para rotular FAPs PDGFRα+ , myofibers de Phalloidin+ e adipócitos expressos perilipin (Figura 4B, Vídeo Suplementar 1 e Vídeo Suplementar 2). Depois de obter imagens em vários z-planes que abrangem até 150 μm de espessura, o módulo de renderização 3D dentro do software de microscópio foi usado para criar uma reconstrução 3D.
Figura 4: Coloração imunofluorescente de montagem total. (A) Visão superior e lateral de como montar a amostra e adicionar tampas para coloração de montagem inteira. (B) Reconstruções 3D representativas de FAPs (verde; esquerda) e adipócitos (vermelho; direita) juntamente com miofibers (cinza) e núcleos (azul). Barras de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Quantificação da gordura intramuscular
Uma vez que as imagens foram tiradas de gordura intramuscular, a função Cell Counter em ImageJ/FIJI foi usada para contar manualmente o número de adipócitos PERLIPIN+ (Figura 5A). Em seguida, foi determinada a área total da seção muscular, bem como a área lesionada, definida por núcleos localizados centralmente dentro dos myofibers. Para controlar a gravidade da lesão, o número total de adipócitos foi dividido pela área lesionada, resultando no número de células de gordura por 1 mm2 de músculo ferido. Normalmente, os TAs que exibem < 30% de lesão são excluídos das quantificações. Note-se que, embora os adipócitos sejam raros sem ferimentos, variando de zero a oito por área transversal, o número total de adipócitos ainda é normalizado pela área total. Como destacado na Figura 5B, uma lesão de glicerol causa grandes quantidades de gordura intramuscular em comparação com um músculo TA ileso. Alternativamente, como a coloração de Perilipin é muito limpa com uma alta relação sinal-ruído, também é possível usar a função Analisar partícula para determinar a área total ocupada por Perilipin. No entanto, este método não será capaz de distinguir entre adipócitos menores versus menos. Até três seções de um mínimo de quatro animais individuais foram imagens e quantificadas, e o número médio de células de gordura presentes por camundongo foi relatado.
Figura 5: Quantificações de gordura intramuscular. (A) Imagem representativa de como contar adipócitos PERILIPIN+ (branco) utilizando a função Contador de Células no ImageJ. Barra de escala: 50 μm. (B) Quantificações completas de adipócitos ta 21 dias após injeção de glicerol normalizada para 1 mm2 da área ferida. Cada ponto representa a média de um mouse. Barras de erro mostradas como SEM. **** = p < 0,0001. (C) camada de RNA após homogeneização e posterior separação de fase por clorofórmio está sendo usada para análise de RT-qPCR. (D) Dobra as mudanças nos níveis de expressão de Pparg e Cepbα, genes adipogênicos precoces, e Plin1 e Adipoq, dois marcadores adipócitos maduros, em diferentes pontos de tempo após lesão glicerol. Cada ponto representa a média de um mouse. Barras de erro mostradas como SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para confirmar independentemente a quantidade de gordura intramuscular presente, podem ser determinados níveis de expressão genética de vários marcadores adipogênicos. Para isso, o RNA pode ser isolado de uma porção do mesmo músculo TA usado para imunofluorescência (ver passos acima) em diferentes pontos pós-lesão. Um batedor de contas foi usado em combinação com tiocianato de guanidium para homogeneizar o tecido. Após a adição de clorofórmio seguido de centrifugação, a camada superior contendo RNA foi cuidadosamente extraída, e mini colunas de spin foram usadas para limpeza de RNA (Figura 5C). Este método produz rotineiramente alta qualidade e quantidade de RNA adequado para todas as análises a jusante, como RT-qPCR e RNAseq. Para o RT-qPCR, os níveis relativos de expressão dos genes adipogênicos à limpeza foram determinados, e quaisquer alterações relativas foram avaliadas após o método ΔΔCT38. Como descrito na Figura 5D, em comparação com o músculo TA não ferido, a lesão do glicerol induz a expressão de marcadores adipogênicos precoces, como Pparg e Cebpα , logo após 3 dias de lesão. Marcadores maduros, como Adiponectin (Adipoq) e Perilipin (Plin1), podem ser detectados logo após a lesão do glicerol.
Rastreamento de linhagem genética de adipócitos
O protocolo de coloração adipócito apresentado aqui pode ser facilmente adaptado para incluir o rastreamento de linhagem genética de FAPs para mapear e seguir seu destino em adipócitos. Demonstramos, por exemplo, anteriormente que a recombinação poderia ser induzida via administração de tamoxifen em PdgfrαCreERT2; CamundongosRosa26 EYFP 2 semanas antes da lesão, removendo efetivamente a codificação de parada floxed e ativando indelibavelmente a expressão EYFP em FAPs (Figura 6A). Conseguimos altas eficiências de recombinação com o regime de tamoxifeno aqui apresentado, com ~75% das FAPs PDGFRα+ expressando EYFP20, semelhante ao que outros laboratórios relataram 27,39,40. Demonstrando que as FAPs são de fato a origem celular da gordura intramuscular, a maioria dos FAPs se transformaram em adipócitos expressos de PERILIPIN 7 dias após lesão glicerol (Figura 6B).
Figura 6: Rastreamento de linhagem de FAPs. (A) Visão geral esquemática da configuração experimental. (B) Imagens imunofluorescentes representativas que mostram recombinação e ativação bem-sucedidas de EYFP (amarelo) dentro de FAPs PDGFRα+ (vermelho, pontas de flecha) e adipócitos PERILIPIN+ (vermelho, asteriscos). Barras de escala: 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Detecção de vários tipos de células
Este protocolo também pode ser usado para visualizar o compartimento miogênico. Usando anticorpos contra PAX7 e MYOD1, células-tronco musculares (MuSCs) e míferas, respectivamente, podem ser prontamente detectadas 5 dias após lesão de glicerol mesmo na seção de tecido muscular fixo pfa (Figura 7). Assim, o protocolo apresentado é versátil e adaptável não só para adipócitos de etiqueta e imagem e FAPs, mas também outros tipos celulares da linhagem miogênica.
Figura 7: Célula-tronco muscular e coloração imunofluorescente myoblast. (A) Visão geral esquemática da configuração experimental. (B) Imagens imunofluorescentes representativas mostrando a coloração bem sucedida de células-tronco musculares (MuSC) (amarelo, esquerda) com PAX7 e myoblasts (amarelo, direita) com MYOD1. LAMININ descreve os miofibers (branco), e os núcleos estão em ciano. Barras de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo suplementar 1: renderização 3D de FAPs. Reconstrução tridimensional de miofibers, FAPs e núcleos manchados para PHALLOIDIN (cinza), PDGFRα (verde) e DAPI (azul), respectivamente, 21 dias após lesão. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo suplementar 2: renderização 3D de gordura intramuscular. Renderização volumosa de pacotes de miofibra (cinza, PHALLOIDIN) e gordura intramuscular (vermelho, PERILIPIN), que substituiu uma lesão de miofibra 21 dias após a lesão de glicerol. Clique aqui para baixar este vídeo.
Este protocolo descreve um protocolo extenso e detalhado que permite uma visualização eficiente e uma quantificação rigorosa da gordura intramuscular. Ao dividir o mesmo músculo em duas partes, sendo uma sendo usada para imunofluorescência e outra para análise rt-qPCR, este protocolo também é muito versátil. Também pode ser combinado com o rastreamento de linhagem genética de FAPs para estudar sua conversão em adipócitos sob certas condições e é altamente adaptável ao rótulo e imagem de vários tipos de células adicionais.
As formas mais utilizadas para visualizar a gordura intramuscular são seções de parafina seguidas de manchas de hematoxilina e eosina ou seções congeladas manchadas para corantes lipofílicos, como o Óleo Vermelho O (ORO). No entanto, enquanto os tecidos processados por parafina mantêm a melhor histologia, o mesmo processo também extrai todos os lipídios impedindo o uso de corantes lipofílicos. Embora os métodos de coloração lipofílica funcionem em seções de tecidos fixos e nãofixados da PFA, as gotículas lipídicas são facilmente deslocadas aplicando pressão ao deslizamento de cobertura, distorcendo assim a distribuição espacial da gordura intramuscular. Para contornar isso, um estudo recente estabeleceu um protocolo rigoroso para visualizar adipócitos ORO+ usando uma abordagem de montagem inteira. Para isso, os autores descelularizaram o TA para visualizar a distribuição espacial da gordura intramuscular em toda a TA41. Por mais poderosa que essa técnica seja, também impede o uso de outras co-manchas para marcar estruturas celulares adicionais. Toda a abordagem de imunofluorescência de montagem apresentada aqui pode ser usada para co-manchar adipócitos com uma variedade de marcadores que permitem um mapeamento fino do ambiente celular. Um grande desafio, no entanto, é a penetração tecidual dos anticorpos. Quanto mais fibras forem mantidas juntas, mais difícil será para os anticorpos penetrarem igualmente e amarrarem todos os antígenos disponíveis. Assim, este método é mais eficaz quando se olha para pequenos grupos de fibras. Ao mesmo tempo, esta também é uma limitação, pois a localização anatômica geral da gordura intramuscular está sendo perdida quando se concentra apenas em pequenos feixes de fibras descascados. No entanto, com o desenvolvimento atual de novos métodos de limpeza de tecidos mais novas tecnologias de imagem, maior penetração e visualização de tecidos serão possíveis no futuro 42,43,44.
Embora a fixação prévia do tecido muscular preserve a morfologia adipócito, também cria um desafio para avaliar o tamanho dos miofibers, uma medida importante da saúde muscular. O tamanho da miofibra é determinado medindo a área transversal dos miofibers. Já noticiamos anteriormente que a fixação prévia do tecido muscular fará com que a maioria dos marcadores disponíveis para delinear myofibersfalhem 31. Para superar esse obstáculo, desenvolvemos um novo pipeline de segmentação de imagens, que permite a medição do tamanho da miofibra mesmo nas seções musculares fixas31. Assim, estabelecemos um robusto e eficiente pipeline de processamento de tecidos que, combinado com este protocolo, supera a maioria das desvantagens causadas pela fixação prévia do tecido muscular.
Outra grande vantagem dessa abordagem é a versatilidade. Ao dividir o TA em duas partes, a quantidade de informações que podem ser obtidas de um músculo é maximizada. Isso não só reduz o número de animais, mas também adiciona uma camada extra de controle, confirmando a histologia através da expressão genética e vice-versa. Além disso, muitos genes diferentes podem ser examinados além de genes adipogênicos. O RNA isolado também pode ser usado para um experimento rnaseq muscular inteiro. Finalmente, a peça muscular congelada também pode ser usada para o trabalho proteico. Uma limitação deste protocolo é a possibilidade de a lesão não ser consistente em toda a extensão do TA. Isso pode levar a um cenário em que as duas partes musculares divergem na quantidade de gordura intramuscular que contêm e podem justificar a exclusão de tal amostra de qualquer análise a jusante. Recomenda-se, portanto, não simplesmente confiar no RT-qPCR para tirar grandes conclusões sobre a quantidade de gordura intramuscular, mas sim como dados de apoio às quantificações histológicas.
Em conjunto, este protocolo descreve um robusto, eficiente e rigoroso pipeline de processamento de tecidos que permitirá a visualização e quantificação da gordura intramuscular, o primeiro passo no desenvolvimento de novas opções de tratamento para combater a fibrose gordurosa. Ao mesmo tempo, é versátil e pode ser adaptado a muitos tipos de células diferentes dentro do músculo, bem como adipócitos em outros tecidos.
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Agradecemos aos membros do laboratório Kopinke por ajudarem na coleta de dados e na leitura crítica do manuscrito. Agradecemos também aos membros do Instituto de Myology da Universidade da Flórida por sua valiosa contribuição sobre o manuscrito. O trabalho foi apoiado pela subvenção do NIH 1R01AR079449. A Figura 2 foi criada com o Biorender.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
16% PFA (Pack of 12, 10 mL bottles) | Electron Miscroscopy Sciences | 15710 | |
2.0 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-138 | microcentrifuge tubes for snapfreezing/bead beating |
2-Methylbutane (4 L) | Fisher Chemical | O3551-4 | isopentane |
Absolute Ethanol (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818100 | |
AffiniPure Fab fragment donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | mouse-on-mouse blocking |
Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A21206 | |
Alexa Fluor 568 donkey anti-goat secondary antibody | Invitrogen | A11057 | |
Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11037 | |
Alexa Fluor 568 Phalloidin antibody | Invitrogen | A12380 | Dissolved in 1.5 mL methanol (~66 µM working solution) |
BioLite 24-well Multidishes | ThermoFisher Scientific | 930186 | 24 well plate for PFA tissue incubation |
Biometra TOne | analytikjena | 8462070301 | Thermal cycler |
Chicken anti-GFP antibody | Aves Labs | GFP-1020 | |
Chloroform/isoamyl alcohol 24:1(v/v) for molecular biology, DNAse, RNAse, and Protease free | ThermoFisher Scientific | AC327155000 | |
Corn oil | Sigma Aldrich | C8267 | |
DAPI stain | Invitrogen | D1306 | 150 µM working solution in dH2O |
Donkey Serum (100 mL) | Millipore Sigma | 5058837 | for blocking solution |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | sharp-tipped tweezers |
Fine Scissors Straight 9 cm | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | mounting medium |
Glycerol, 99.5%, for molecular biology (500 mL) | Acros Organics | 327255000 | |
Goat anti-PDGFRα antibody | R&D | AF1062 | |
Hybridization Oven | VWR | 230301V | for Tamoxifen incubation |
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | hydrophobic pen |
Insulin Syringe with Micro-Fine IV needle (28 G) | BD | 329461 | |
Insulin Syringe with Slip Tip, 1 mL | BD | 329654 | Insulin syringe without needle, for oral gavaging |
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 78938441 | |
Leica DMi8 inverted microscope | Leica | micrscope used for widefield IF and confocal imaging | |
Micro Slides | VWR | 48311-703 | positively charged microscope slides |
mouse anti-MYOD antibody | Invitrogen | MA1-41017 | |
mouse anti-PAX7 antibody (supernatant) | DSHB | AB 428528 | |
MX35 Premier+ Microtome blades | ThermoFisher Scientific | 3052835 | microtome blades |
NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND2000 | spectrophotometer for RNA yield |
Play-Doh | Hasbro | modeling compound | |
PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher Scientific | A25742 | green dye PCR master mix |
Puralube Vet Ointment | Puralube | 17033-211-38 | vet ophthalmic ointment |
QuantStudi 6 Flex Real-Time 384-well PCR System | Applied Biosystems | 4485694 | qPCR machine |
Rabbit anti-perilipin antibody | Cell Signaling Technology | 9349S | |
Red-Rotor Shaker | Hoefer Scientific | PR70-115V | shaker for IF staining |
Richard-Allan Scientific Slip-Rite Cover Glass | ThermoFisher Scientific | 152460 | coverslips |
RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | contains mini spin columns |
Safe-Lock Tubes 1.5 ml, natural | Eppendorf | 22363204 | |
Sample Tubes RB (2 mL) | QIAGEN | 990381 | |
Sodium azide | Alfa Aesar | 14314 | |
Stainless Steel Beads, 2.8 mm | Precellys | KT03961-1-101.BK | small beads |
Stainless Steel Beads, 5 mm | QIAGEN | 69989 | medium beads |
Stainless Steel Beads, 7 mm | QIAGEN | 69990 | large beads |
Stainless Steel Disposable Scalpels | Miltex | 327-4102 | scalpel |
Stainless steel feeding tube, 20 G x 38 mm, straight | Instech Laboratories | FTSS-20S-3 | gavage needle |
Tamoxifen | Toronto Research Chemicals | T006000 | |
Tissue Plus O.C.T. Compound | Fisher HealthCare | 4585 | embedding medium |
TissueLyser LT | QIAGEN | 85600 | bead beater |
TissueLyser LT Adapter, 12-Tube | QIAGEN | 69980 | |
Tissue-Tek Cryomold | Sakura | 4566 | specimen molds |
Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | guanidium thiocyanate |
Tween20 (500 mL) | Fisher BioReagents | BP337-500 | |
VWR Micro Slides - Superfrost Plus | VWR | 48311703 | |
Wheaton Coplin staining jars | Millipore Sigma | S6016 | Coplin jar |
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